Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
Были приобретены самки мышей класса <"jove_content">C57BL/6 (H-2
b) в возрасте 8 недель, а также мыши C57BL/6 AQP4
-/- от А. Веркмана.
1. Иммунизация мышей пептидами AQP4
- Подготовьте полный рабочий состав адъюванта Фрейнда (КФА).
- Мелко измельчите высушенный препарат Mycobacterium tuberculosis (H37Ra) с помощью ступки и пестика.
- Добавьте молотый H37Ra в неполный адъювант Фрейнда до конечной концентрации 4 мг/мл. КФА можно хранить при температуре 4 °C до 6 месяцев.
- Растворите пептид лиофилизированного антигена (Ag) AQP4 в фосфатно-солевом буфере (PBS) до конечной концентрации 1 мг/мл. Хранить при температуре 4 °C или на льду.
- Подготовьте сборку из 2 шприцев с люэровским замком, соединенных запорным краном, содержащих CFA/пептидную эмульсию.
- Прикрепите стеклянный шприц с люэровским замком без поршня к 3-ходовому нейлоновому запорному крану с 2 наружными соединениями люэровского замка. Закройте запорный кран, переключив рычаг в сторону шприца. Расположите открытый конец шприца вверх, позволяя шприцу действовать как пробирка. Поместите его в штатив для пробирок для дополнительной устойчивости.
- Вихревой рабочий состав CFA и раствор Ag. Добавьте в открытый шприц объем пептида / КЖК в соотношении 1:1. На одну мышь требуется 200 μл CFA/Ag (4 x 50 μL).
заметка: Как правило, около 1 мл препарата теряется в запорном кране, что снижает количество, доступное для иммунизации. Поэтому важно учитывать это при расчете общего необходимого объема.
Пример: Для иммунизации 5 мышей: (200 мкл/животное x 5 животных) + 1 мл дополнительного объема = 2 мл общего объема КФА/Ag.
- Вставьте стеклянный поршень в шприц и, удерживая его на месте, переверните шприц так, чтобы запорный кран был ориентирован вверх. Переключите рычаг запорного крана на неиспользуемое гнездовое соединение. Осторожно надавите на стеклянный поршень для того, чтобы удалить лишний воздух из шприца. Жидкость заполняет второе наружное соединение люэр-лок запорного крана.
- Присоедините второй стеклянный шприц (полностью вставленный поршень) ко второму наружному разъему люэр-замка запорного крана. Это должна быть закрытая система из 2 стеклянных шприцев, соединенных с запорным краном, содержащим как можно меньше лишнего воздуха.
- Чтобы создать эмульсию, перемешивайте, нажимая на поршни, чтобы жидкость попеременно пропускалась между 2 шприцами в течение примерно 2 мин. Охладите шприцы на льду в течение примерно 10 мин. Повторяйте охлаждение и перемешивание до тех пор, пока не произойдет явное изменение вязкости препарата, в результате чего получится очень жесткая белая эмульсия. Охладите шприцы, содержащие эмульсию, при температуре 4 °C или держите на льду.
- Перелейте всю эмульсию в один стеклянный шприц люэровского замка, извлеките пустой стеклянный шприц и замените его шприцем люэровского замка объемом 1 мл для инъекций. Наполните новый шприц эмульсией, снимите его со стопорного крана и прикрепите иглу (25G x 5/8).
- «Проверьте» эмульсию на консистенцию. Выдавите каплю эмульсии в небольшую миску с водой. Эмульсия не должна рассеиваться, что говорит о том, что она пригодна для инъекций.
- Если эмульсия диспергируется, она не готова к инъекции; перелейте жидкость обратно в стеклянные шприцы и продолжайте перемешивать, а затем снова охладите, пока эмульсия не станет жесткой.
- Снова проверьте эмульсию до тех пор, пока не будет достигнута надлежащая консистенция.
- Мышам-донорам AQP4-/- подкожно (подкожно) вводят эмульсию, содержащую пептид AQP4. Каждая мышь получает 4 инъекции по 50 мкл в.к. (всего 200 мкл (100 мкг пептида)). 4 участка включают обе стороны нижней части живота, которые дренируются в паховые лимфатические узлы (ЛН), и обе стороны грудной стенки медиально к каждой подмышечной впадине, которые впадают в подмышечные ЛН. Для усыновления потребуется 1-2 иммунизированные мыши-доноры на одну мышь-реципиента.
2. Культура Т-клеток и провоспалительная поляризация Т-клеток
- Через 10-12 дней после иммунизации соберите ЛУ у мышей.
- В лотке для льда приготовьте чашки Петри диаметром 60 мм, снабженные сетчатым фильтром (размер ячеек 70 мкм) и содержащие охлажденные среды Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI) с 10% инактивированной температурой фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллин-100 мкг/мл стрептомицина (пен-стрептококка) (RFPS).
- Усыпляйте мышей путем воздействияCO2 с последующим вывихом шейки матки. Погрузите мышей в 70% этанол, а затем приколите каждую подушечку для ног к доске для вскрытия.
- Сделайте разрез кожи по средней линии от паха до шеи и вниз по каждой ноге. Оттяните кожу от брюшины и плотно приколите ее к доске. Рассеките паховую и подмышечную ЛН и поместите в чашку Петри, содержащую RFPS, на лед.
- Для экспериментов по адоптивному переносу комбинируйте LN от всех животных в одной группе иммунизации. Для проточного цитометрического анализа использования Vβ отделяют LN от отдельных животных.
- Поместите сетчатый фильтр с LN на центрифужную пробирку объемом 50 мл с RFPS. Используйте плоский конец стерильного поршня шприца объемом 5 мл, чтобы продавить клетки LN через ситечко, промыв 20-30 мл RFPS для облегчения восстановления клеток. Поддерживайте клетки LN на льду на протяжении всей обработки до момента культивирования.
- Промыть дважды, центрифугируя при 393 х г в течение 5 минут. После второй промывки ресуспендируйте LN-клетки в среде Т-клеток (TCM). ТКМ содержит RPMI с 10% инактивированным при нагревании FBS, 292 мкг/мл L-глутамина, 110 мкг/мл пирувата натрия и 55 мкМ 2-меркаптоэтанола и пен-стрептококка. Как правило, используется объем 5 мл ТКМ на одну донорскую мышь.
- Посчитайте ячейки LN. Ожидаемый выход составляет примерно 3-6 x 107 LN клеток на одного иммунизированного донора мыши.
- Настройте поляризующие культуры для усыновляющего переноса.
- Получить поляризационную культуру Th17 из 5 x 106 LN клеток на мл с 10 мкг/мл Ag, 20 нг/мл рекомбинантного мышиного интерлейкина (IL)-23 и 10 нг/мл рекомбинантного мышиного IL-6 в ТКМ.
- В качестве альтернативы, для поляризации Th1 готовят культуру из 5 x 106 LN клеток на мл с 10 мкг/мл Ag и 10 нг/мл рекомбинантного мышиного IL-12 в ТКМ.
- Добавьте 2 мл (1 x 107 клеток) на лунку поляризационной питательной смеси в 12-луночный планшет. LN-клетки от 2-4 мышей-доноров заполнят одну 12-луночную пластину. Выдерживайте культуры в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5% CO2 в течение 72 часов.
- Визуально проверьте LN-клетки в культуре на предмет активации через 48 ч и 72 ч. Активированные клетки образуют обширные кластеры, а Т-клетки увеличиваются в размерах, становясь более плеоморфными. Увеличение метаболизма вызовет понижение pH в среде, изменение с персикового на оранжевый. Если pH достаточно низкий, чтобы среда стала желтой, добавьте 1 мл свежей ТКМ, чтобы предотвратить токсичность для клеток в оставшиеся 24 часа.
- Приступайте к передаче в связи с усыновлением.
3. Адоптивный перенос патогенных AQP4-специфичных Т-клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг следует из раздела 2.5: Культура Т-клеток и провоспалительная поляризация Т-клеток.
- Восстановите поляризованные клетки из 12-луночных планшетов путем пипетирования вверх и вниз для смещения и переноса их в пробирку объемом 50 мл. Держать на льду до уколов.
- Подсчитайте клетки, промойте их дважды в холодном PBS и приготовьте суспензию 1 x 108 клеток/мл в PBS. Как правило, клетки вводят в течение часа.
- Аккуратно перемешайте клетки, взболтав их, и переложите их в шприц объемом 1 мл во время инъекции. Введите 200 мкл клеток (2 x 107) внутривенно (в/в) каждой мыши через хвостовую вену.
- Введите каждой мыши-реципиенту 200 нг токсина B. pertussis, разведенного в 200 мкл PBS в тот же день и через 2 дня. Ежедневно наблюдайте за мышами на предмет признаков клинического заболевания.
