Иммунофлуоресцентное окрашивание популяций нейронов в желудочно-кишечном тракте эмбрионов мышей

Аннотация

Источник: Barlow-Anacker, A. J., et al., Иммуноокрашивание для визуализации развития кишечной нервной системы мышей. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует иммуноокрашивание желудочно-кишечного тракта эмбриональной мыши для визуализации и анализа распределения нейрональной популяции с помощью иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Протокол иммуноокрашивания

1. Если образцы хранились в 30% сахарозе, промойте их 3 раза в течение 20 минут в 1x PBS на качающейся платформе.
2. Поместите желудочно-кишечные тракты в блокирующее решение на качающуюся платформу на 1 час в RT.
3. Удалите блокирующий раствор и инкубируйте желудочно-кишечные тракты с соответствующим количеством первичных антител, разведенных в блокирующем растворе, в течение 4 часов при ОТ или О/Н при 4 °C на качающейся платформе. Используйте разведение человеческого антитела против Hu в соотношении 1:1000 (сыворотка, полученная от пациента), разведение антитела куриного антизеленого флуоресцентного белка (GFP) в соотношении 1:100 и разведение антитела против ChAT козы в соотношении 1:100.
   заметка: Мы используем человеческое антитело против Ху, которое было получено локально от пациента; тем не менее, антитела против Hu коммерчески доступны, например, мышиный анти-Hu (использование в разведении 1:500).
4. Промывайте желудочно-кишечные тракты в 1x PBS 3 раза в течение 5 минут, а затем в течение 1 часа в RT на качающейся платформе.
5. Замените 1x PBS вторичными антителами, разведенными в соотношении 1:500 в блокирующем растворе на качающейся платформе в течение 4 часов при RT или O/N при 4 °C. Используйте античеловеческий аминоспособный краситель, такой как Dylight, donkey anti-chicken Cy2 и donkey anti-goat Cy5. Если вы используете мышиное антитело против Hu, то используйте разведение в масштабе 1:500 ослиного антимышиного аминоспособного красителя 405.
   заметка: Интенсивность эндогенной экспрессии GFP и tdTomato, а также ясность иммуноокрашивания увеличиваются с возрастом развития. Обычно мы иммуноокрашиваем кишечник эмбриона индивидуально в пробирках объемом 0,2 мл 150 мкл окрашивающего раствора, чтобы уменьшить объем используемых антител, а также обеспечить эффективное окрашивание тканей.
6. Промывайте желудочно-кишечные тракты в 1x PBS 3 раза в течение 5 минут, а затем в течение 1 часа в RT на качающейся платформе.
7. Нанесите несколько капель флуоресцентного монтажного средства с DAPI на предметное стекло. Погрузите желудочно-кишечный тракт в флуоресцентную среду и добавьте покровное стекло непосредственно поверх ткани. Флуоресцентная монтажная среда -G представляет собой водорастворимое соединение, обеспечивающее полупостоянное уплотнение.
   заметка: Используйте флуоресцентную монтажную среду, такую как Vectashield, монтажную среду на основе глицерина, которая предотвращает выцветание антител и фотообесцвечивание. Оба эти продукта позволяют хранить ткани в течение длительного периода времени при температуре 4 °C.
8. Получите изображения каждого флуорофора с помощью конфокального микроскопа. Используйте длины волн возбуждения для флуорофоров и фильтров, используемых в таблице 1.
9. Выполняйте компьютерный анализ изображений с помощью соответствующего программного обеспечения в зависимости от типа конфокального фильтра, используемого для захвата изображений.

Таблица 1: Длины волн возбуждения конфокальной визуализации, флуорофоры и фильтры. Представлены длины волн возбуждения, обнаруживаемые флуорофоры и используемые фильтры. Эта информация может быть использована при выборе комбинаций вторичных антител для многоцветной иммунофлуоресценции.

Возбуждение			Излучение
Лазерная линия	Тип флуорофора	Примеры	Фотоумножитель	Параметры фильтра
408 нм	синий	Alexa Fluor 405, Cascade Blue, Coumarin 30, DAPI, Hoechst, Pacific Blue, большинство квантовых точек	1	БП 425-475 нм
488 нм	зеленый	Alexa Fluor 488, ATTO 488, Calcein, Cy2, eGFP, FITC, Oregon Green, YO-PRO-1	2	БП 500-550 нм
561 нм	красный	Alexa Fluor 546, 555, 568 и 594, Cy3, DiI, DsRed, mCherry, фикоэритрин (PE), йод пропидия (PI), RFP, TAMRA, tdTomato, TRITC	3	БП 570-620 нм
638 нм	Дальний красный	Alexa Fluor 633 и 647, Аллофикоцианин (APC), Cy5, TO-PRO-3	4	БП 663-738 нм

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буфер	Оксоидный	BR0014G
Бычий сывороточный альбумин	рыбак	БП1605
Тритон Х-100	сигма	Х100
Флуоресцентный прицел	Компания Nikon	Стереоскоп СМЗ-18
1,5 мл пробирок Eppendorf	ВВР	20170-038
Фторомант-Г	SouthernBiotech, Бирмингем, Алабама	0100-01
Стеклянные предметные стекла	рыбак	Телефонный номер 12-550-15
Покровное стекло	ВВР	16004-330
Конфокальный микроскоп	Компания Nikon	Никон А1
Элементы Nikon	Компания Nikon