Индукция нейровоспаления у мышей путем инъекции альфа-синуклеиновых фибрилл

Аннотация

Источник: Breid, S. et al. Биолюминесцентная визуализация нейровоспаления у трансгенных мышей после периферической инокуляции фибрилл альфа-синуклеина. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует инъекцию альфа-синуклеиновых фибрилл мыши, чтобы вызвать нейровоспаление. Фибриллы вводятся внутрибрюшинно трансгенной мыши, экспрессирующей мутировавшие белки альфа-синуклеина. Достигая центральной нервной системы, фибриллы проникают в нейроны и индуцируют агрегацию мутировавших белков. Агрегаты распространяются на соседние нейроны, микроглию и астроциты. Распознавание агрегатов запускает микроглию, которая вызывает нейровоспаление, повреждая нейроны.

Протокол

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Животная модель

1. Скрещивание гемизиготных мышей Tg(Gfap-luc^+/-) (трансгенных мышей, экспрессирующих люциферазу светлячков) с гемизиготными мышами Tg(M83^+/-) (трансгенные мыши, экспрессирующие человеческий альфа-синуклеин с семейной мутацией A53T) для получения гемизиготных больших мышей Tg(M83^+/-:Gfap-luc^+/-).
2. Генотипировать потомство с помощью полиэмеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на наличие трансгена, кодирующего альфа-синуклеин человека, и стандартной ПЦР на люциферазу светлячков.
3. Прививайте животных в возрасте от шести до восьми недель.

2. Подготовка инокулюма

1. Получить мономерный рекомбинантный человеческий альфа-синуклеин с мутацией A53T в трис-буферном физрастворе (TBS), содержащем 150 мМ NaCl в 20 мМ Tris-HCl (pH 7,2).
2. Подготовьте фибриллярный альфа-синуклеин для посевов путем перемешивания 3 мкг/мл мономерного рекомбинантного альфа-синуклеина человека в орбитальном шейкере при 800 об/мин и 37 °C в течение 5 дней.
3. Разбавьте фибрильные сборки в фосфатно-солевом буфере (PBS) до достижения конечной концентрации 1 мкг/мкл для внутрибрюшинных посевов.
4. Фрагментировать фибриллы альфа-синуклеина палочковым ультразвуковиком в течение 1 мин (40 импульсов длительностью 0,5 с с паузой в одну секунду между каждым импульсом и амплитудой 50%) на льду. Чтобы избежать загрязнения при перекрестном посеве, используйте чистые ультразвуковые щупы для приготовления различных инокулятов.

3. Внутрибрюшинные инъекции

1. Для внутрибрюшинных инъекций животным следует ввести наркотики в течение короткого времени в анестезиологической камере путем ингаляции изофлураном/кислородом со скоростью потока 2 л/мин и установленным на 2% испарителем. Ущипните палец ноги животного и подтвердите, что оно не отводит заднюю конечность, чтобы обеспечить надлежащую анестезию.
2. Наполните одноразовый шприц для подкожных инъекций массой 27 г 50 мкл ультразвукированных альфа-синуклеиновых фибрилл или PBS.
3. Вводите препарат непосредственно в брюшину мыши и избегайте проникновения в тонкую кишку или слепую кишку, расположенную за брюшной стенкой, удерживая животное в дорсальном положении головой в сторону от исследователя и вниз под углом примерно 45°. Наблюдайте за животными до тех пор, пока они не оправятся от анестезии.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Инвитроген	14190169
Шприц 27 калибра	ВВР	613-4900
Изофлуран	Пирамал Хелсинг	ПЗН 4831850
Ультразвуковой аппарат Sonopuls Mini20	Банделин	No 3648
Tg(M83+/-) мыши или B6; C3-Tg(PrnpSNCA*A53T)83Vle/J мыши	Лаборатория Джексона	4479