Покадровая визуализация для мониторинга трансцеллюлярного распространения прионоподобных белков у трансгенных нематод

Аннотация

Источник: Nussbaum-Krammer, C. I., et al. Исследование распространения и токсичности прионоподобных белков с использованием модельного организма многоклеточных C. elegans. J. Vis. Exp. (2015)

Это видео демонстрирует процедуру визуализации in vivo C. elegans, экспрессирующих прионоподобные белки, помеченные красным флуоресцентным белком. Протокол включает в себя иммобилизацию нематод на агарозной прокладке для покадровой конфокальной микроскопии, выявляющей агрегацию белков и транспорт внутри и между клетками. Этот метод имеет решающее значение для изучения агрегации белков, связанной с нейродегенеративными заболеваниями.

Протокол

1. Мониторинг трансцеллюлярного распространения прионоподобных белков с помощью покадровой визуализации in vivo

ПРИМЕЧАНИЕ: Выращивайте C. elegans дикого типа (WT) (N2) и трансгенные линии в соответствии со стандартными методами и тщательно контролируйте температуру выращивания.

1. Создание трансгенных линий C. elegans, экспрессирующих прионоподобный белок, помеченный мономерным красным флуоресцентным белком (mRFP).
2. Подготавливают синхронизированные популяции путем закладки яиц или обесцвечивания в соответствии со стандартными методами.
   1. Синхронизация по яйцекладке
      1. Переложите 10 - 20 взрослых особей на тарелку и дайте им отложить яйца в течение 1 - 2 часов. Удалите взрослых особей из тарелки и дайте потомству вырасти до желаемого возраста.
   2. Синхронизация методом отбеливания
      1. Соберите несинхронизированную популяцию взрослых особей и отбеливайте их раствором щелочного гипохлорита (250 мМ гидроксида натрия (NaOH) и 1:4 (v/v) разбавления товарного отбеливателя в воде (H2 O)). Яйца дважды вымыть (218 х г в течение 1 мин) с буфером M9 (21 мМ Na₂HPO₄·7H₂O (гидрофосфат натрия гептагидрат), 22 мМ (гидрофосфат калия) KH₂PO₄, 86 мМ хлорида натрия (NaCl), 1 мМ MgSO₄·7H₂O (гептагидрат сульфата магния), добавить dH₂O до 1 л).
      2. Дайте им вылупиться в буфере M9 с легким перемешиванием в течение ночи (O/N) при 20 °C. Развитие червей будет остановлено на стадии L1 в отсутствие источника пищи, в результате чего останется синхронизированная популяция. Перенесите L1 на свежие нематодные питательные среды (NGM), засеянные бактериями OP50 E. coli, и дайте потомству развиваться до желаемого возраста.
3. Приготовьте 2% агарозные прокладки (в H₂O) на предметном стекле микроскопа, как описано.
   1. Подготовьте два предметных стекла микроскопа с маркировочной лентой, размещенной по всей их длине, для использования в качестве спейсеров. Поместите между ними третье предметное стекло микроскопа.
   2. Растворите 2% агарозу в_H2O и пипеткой по одной капле на чистое предметное стекло.
   3. Поместите четвертое горло перпендикулярно трем другим предметным стеклам поверх агаровой капли. Аккуратно прижмите ее, чтобы разровнять подушечку до той же толщины, что и этикетировочная лента.
   4. Дайте ему высохнуть в течение 1 минуты, прежде чем снять распорки и аккуратно раздвинуть слайды. Агаровая прокладка будет прилипать к одному из них.
4. Пипеткой нанесите ~10 мкл анестетика (2 мМ левамизола в буфере M9) на планшет и перенесите ~10 животных с помощью медиатора из платиновой проволоки. Накройте крышкой (~22 x 22 мм) и делайте снимки в течение 1 часа.
5. В качестве альтернативы, чтобы приобрести пленки в течение более длительного периода времени или еще больше уменьшить возможность любого движения животных, используйте комбинацию анестезии и обездвиживания бусинами.
   1. Приготовьте 10% агарозные прокладки (в буфере М9), как описано выше, и добавьте червей в раствор наносферных стандартных размеров объемом 3 мкл (гранулы полистирола, 100 нм) плюс 3 мкл анестетика (4 мМ левамизола в буфере М9). Аккуратно накройте крышкой. Во избежание высыхания запечатайте покровную крышку VALAP (смесью равных количеств вазелина, ланолина и парафина).
6. Визуализируйте обездвиженных червей с помощью конфокального микроскопа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты получены с помощью конфокального микроскопа с вращающимся диском, оснащенного камерой EM-CCD, и программного обеспечения для автоматизации микроскопии и анализа изображений, такого как MetaMorph, но также могут быть использованы другие сопоставимые системы конфокальной визуализации.
   1. Используйте масляный объектив 63X или 100X/1.4NA и поместите предметное стекло микроскопа с червями в держатель предметного стекла микроскопа.
   2. Откройте программу. Отрегулируйте мощность лазера и фильтры для визуализации mRFP. Используйте лазер с длиной волны 561 нм при мощности 10% и фильтре излучения >600 нм.
   3. Откройте «Многомерное получение». На вкладке «Основные» установите флажки «Таймлапс» и «Запустить журналы» (Аппаратная автофокусировка: выключена).
   4. На вкладке "Сохранение" выберите или создайте папку каталога, в которой должны быть сохранены файлы. Назначьте имя файлу.
   5. На вкладке "Длина волны" выберите подходящую освещенность и отрегулируйте экспозицию и усиление. Используйте «YokoQuad Red» (или эквивалентную настройку освещенности для визуализации mRFP) с экспозицией от 100 до 300 мс и усилением камеры от 100 до 300, в зависимости от отдельного образца (оценивается с помощью изображения в реальном времени).
   6. На вкладке «Таймлапс» выберите «Количество временных точек» = 301, «Продолжительность» = 5 минут и «Время/интервал» = 1 секунда.
   7. На вкладке "Журналы" выберите Журнал: "AFC SET Z HOLD" и "AFC Return to Z HOLD", Тип: "Специальный" (дважды), Начальная точка: "Начало временной точки" и "Конечная временная точка". Этот параметр автофокусировки важен для отображения одного и того же участка в течение длительного периода времени.
   8. Когда настройка будет завершена, нажмите «Получить». Таймлапс-видео будет сохранено в виде отдельных файлов TIFF.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
реагент
Стандарты размеров наносфер 100 нм	ТермоСайентиал	3100А
Левамизол	сигма	Л-9756
оборудование
Рефрижераторная центрифуга Sorvall Legend XTR, 120 В переменного тока	ТермоСайентиал	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
96-контактный репликатор	Сциономикс		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro высокопроизводительный инкубационный шейкер	Дигилаб		http://www.digilabglobal.com/higro
Дозатор реагентов Multidrop Combi	Титертрек		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Автоматизированная рабочая станция Biomek FX AP96	Бекман Коултер		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Шейкер Innova44	Нью-Брансуик		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389
М205 ФА	Лейка		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BДигитальная ПЗС-камера	Хамамацу		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Конфокальный микроскоп с вращающимся диском AF	Лейка		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Фотоаппарат Falcon 4M60	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
программное обеспечение
Программное обеспечение MetaMorph для автоматизации микроскопии и анализа изображений	Молекулярные приборы		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Программное обеспечение для анализа изображений Hamamatsu SimplePCI	Инструменты Meyer		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ИзображениеJ	НИЗ		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Плагин wrMTrck для ImageJ			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
Штаммы C. elegans
N2 (WT)	Центр генетики ценорхабдита (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570