Методическая статья

Инъекция вирусного вектора в черную субстанцию крысы для моделирования нейродегенеративных заболеваний

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Van der Perren, A. et al., Разработка модели болезни Паркинсона на основе альфа-синуклеина у крыс с помощью стереотаксической инъекции рекомбинантного аденоассоциированного вирусного вектора.J. Vis. Exp.(2016).

Это видео демонстрирует процесс введения вирусного вектора в крысу substantia nigra для моделирования болезни Паркинсона. В нем описаны этапы подготовки крысы, микроинъекции вирусного вектора в черную субстанцию и процедура восстановления.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Производство и очистка рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV)

Примечание: производство и очистка векторов rAAV были выполнены с помощью Leuven Viral Vector Core (LVVC).

  1. Вкратце, трансфектируйте субконфлюентные клетки с низким (<50) проходом адгезивные клетки HEK 293T с использованием линейного раствора для трансфекции NaCl из полиэтиленимина 25 кД и трех различных плазмид в соотношении 1:1:1 в среде DMEM 2% фетальной бычьей сыворотки. После 24 часов инкубации при 37 °C при 5%CO2 замените среду свежей средой DMEM 2% фетальной бычьей сывороткой.
    заметка: Плазмиды включают в себя конструкции серотипа AAV7, транспортную плазмиду AAV, кодирующую мутантный альфа-синуклеин A53T человека (α-SYN) под контролем усиленного промотора синапсина1 CMVie, и аденовирусную хелперную плазмиду pAdvDeltaF6.
  2. Соберите среду через 5 дней после переходной трансфекции и сосредоточьтесь с использованием тангенциальной фильтрации.
  3. Очистите векторные частицы rAAV от концентрированной среды с помощью ступенчатого градиента йодиксанола.
  4. Используйте стандартные методы ПЦР в реальном времени для определения геномной копии (ГК). В этом протоколе векторный титр 3,0 E11 GC/мл был использован для разработки модели болезни Паркинсона (БП) на основе α-SYN.

2. Стереотаксическая инъекция rAAV α-SYN Vector в черную субстанцию (SN) крысы (Рисунок 1)

  1. Содержать восьминедельных самок крыс Вистар весом около 200-250 г при нормальном 12-часовом цикле свет/темнота со свободным доступом к гранулированному корму и водопроводной воде.
  2. Подвергните крысу внутрибрюшинной анестезии, содержащей смесь кетамина (60 мг/кг) и медетомидина (0,4 мг/кг). После того, как крыса находится под наркозом и не реагирует на сдавливание разных лап, введите микротранспондер подкожно на спину крысы для дальнейшего распознавания с помощью имплантатора микротранспондера. Проверьте, правильно ли расположен микротранспондер и может ли он считываться считывающим устройством.
  3. Подстригите волосы на макушке кожи головы. Нанесите местный анестетик на кожу головы и уши. Выполняйте остальную часть хирургической процедуры под ламинарным потоком с использованием асептических техник.
  4. Поместите крыс в стереотаксическую рамку для головы, используя две ушные планки, рот и носовую планку. Накройте тело крысы бумажным одеялом, чтобы избежать падения температуры тела. Нанесите глазную смазку, чтобы предотвратить высыхание глаз.
  5. Продезинфицируйте кожу головы йодием 1% в изопропаноле 70% и сделайте небольшой разрез по средней линии кожи головы. Аккуратно соскребите мембраны на черепе и промойте солевым раствором. Дайте черепу обсохнуть в течение нескольких минут. Обратите внимание на черепные швы и две опорные точки: Брегма и Лямбда.
  6. Чтобы ввести вектор rAAV в SN, определите координаты в направлении Bregma (переднезадняя: 5,3 мм; медиолатеральная: 2,0 мм; и дорсовентральная: 7,2 мм, рассчитанная от твердой мозговой оболочки).
    заметка: Трехмерные координаты для каждой области интереса могут быть рассчитаны с помощью стереотаксического атласа мозга крысы, используя Брегму в качестве анатомической точки отсчета.
  7. Наполните шприц для микроинъекций объемом 10 мкл (30-й калибр 20 мм) вектором rAAV и поместите его в стереотаксический инструмент, подключенный к моторизованному насосу микровпрыска. Контролируйте объем, выпустив каплю вектора, и устраните в поливалентном моющем средстве pH 9 (например, RBS).
  8. Визуально проверьте, закреплена ли голова прямо в каркасе головы, и оцените ось влево-вправо. Тщательно визуально определите переднезадние и медиолатеральные координаты для Bregma и Lambda и измерьте их высоту с помощью иглы 30 калибра 20 мм в дорсовентральном плече стереотаксической рамки.
    1. Допускайте максимальную разницу в высоте 0,3 мм между Bregma и Lambda. Поместите иглу обратно на Bregma и примените переднезаднюю и медиолатеральную координаты, перемещая переднезаднее и медиолатеральное плечо стереотаксической рамки.
  9. В месте инъекции измерьте высоту черепа и убедитесь, что она не отличается более чем на 0,3 мм от высоты Брегмы. Просверлите отверстие в черепе диаметром примерно 2 мм. Измерьте высоту твердой мозговой оболочки, которая послужит ориентиром для применения дорсовентральной координаты. В качестве альтернативы можно вычесть фиксированную толщину черепа (0,9 мм).
  10. Проникните в твердую мозговую оболочку с помощью иглы 26 калибра и впитайте кровь стерильной тканью. Подождите, пока кровотечение не остановится, прежде чем продолжить.
  11. Медленно введите шприц для микроинъекций объемом 10 мкл, предварительно загруженный векторным раствором, в мозг на заданную глубину (дорсовентральная координата). Подождите 1 минуту, установив иглу на место. Введите 3 μл векторного раствора (3,0 E11 копий генома/мл (средняя векторная доза) или 1,0 E12 GC/мл (высокая векторная доза) rAAV2/7 α-SYN или контрольный вектор eGFP) с помощью моторизованного микроинжекционного насоса с производительностью 0,25 μл/мин.
  12. После инъекции удерживайте иглу на месте еще 5 минут, прежде чем медленно извлечь ее. Прострочите кожу головы с помощью плетеного полиэстера с покрытием 3.0, продезинфицируйте 1% йодия в 70% изопропанола и аккуратно снимите животное со стереотаксического инструмента. Сначала ослабьте носовую и ротовую дуги, затем две ушные дуги.
  13. Чтобы отменить анестезию, введите крысе внутрибрюшинно 0,5 мг/кг атипамезола и поместите крысу в чистую клетку на нагревательную пластину с температурой 38 °C до тех пор, пока она не проснется. Накройте крысу бумажным одеялом, чтобы предотвратить падение температуры тела.
  14. Обеспечьте легкий доступ к еде и воде в первые часы. Наблюдайте за крысой в течение первых нескольких дней. При необходимости применить анальгезию.
    заметка: Нет необходимости снимать швы с черепа. Через 1-2 недели череп полностью восстанавливается, а швы отслаиваются.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Стереотаксическая инъекция вектора rAAV2/7, кодирующего α-SYN, в SN крысы. (А, В, Е) Черепные швы на черепе крысы, определяющие две опорные точки: Брегма и Лямбда. (C) Стереотаксический атлас мозга крысы, представляющий область инъекции, а именно SN. (D) Крыса Вистар, расположенная в стереотаксической голо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Самки 8-недельных крыс ВистарЖанвье200-250 г
Кетамин (Ниматек)Здоровье животных Eurovet804132
Медетомидин (Dormitor)Орион-Фарма/ Янссен Здоровье животных1070-499
Местный анестетик для кожи головы и ушей: Ксилокаин 2% гельАстразенека0137-547 (Английский)
ТеррамицинКомпания Pfizer0132-472 (Английский)
Бупренорфин (Ветергезик)Экуфар2623-627
Йодий 1% изопропанолаВВР0484-0100 (Английский
Стереотаксический каркас головыШтелинг
Шприц Гамильтона (30 калибр -20 мм -pst 2)Hamilton/ Сервис фильтров7803-07
атипамезол (Антиседан)Орион-Фарма/Эланко1300-185
Вектор rAAV A53T α-SYNLVVC, KU Leuvenhttps://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
DMEM, глутамаксТехнологии LifeНомер 31331-093
Фетальная бычья сывороткаТехнологии LifeN° 10270-106
25 кД линейный полиэтиленимин (ПЭИ)Полинауки
OptiPrep Градиентная среда для плотности: йодиксанолсигмаД1556-250МЛ
ОптименТехнологии LifeN° 51985-026
Патсинос 1 Уотстон стеретактический атлас, четвертое изданиеЭльзевир
гг. ) гг.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

AAV

Похожие статьи