$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Гомогенизация и фракционирование
- Выбор ткани
ПРИМЕЧАНИЕ: Были отобраны замороженные посмертные ткани лобной коры из здоровых контрольных групп (Ctl) и патологически подтвержденных случаев болезни Альцгеймера (n=2). Посмертная нейропатологическая оценка распределения амилоидных бляшек проводилась в соответствии с критериями полуколичественной оценки Консорциума по созданию регистра болезни Альцгеймера, хотя патология нейрофибриллярного клубка оценивалась в соответствии с системой стадирования Браака.
- Получение замороженной посмертной ткани мозга из здоровых контрольных (Ctl) и патологически подтвержденных случаев болезни Альцгеймера. Используя контейнеры с сухим льдом, щипцы и бритвенное лезвие, вырезайте ~ 250 мг порций серого вещества из каждого образца ткани на тарированных одноразовых весах, стараясь предотвратить оттаивание ткани. Запишите вес каждого предмета, который нужно гомогенизировать.
- Удалите ~ 250 мг серого вещества с помощью щипцов и бритвы путем визуального осмотра, чтобы найти границу раздела между внешним серым веществом и внутренним белым веществом. Избегайте белого вещества и, что более важно, любых крупных кровеносных сосудов или кровянистых областей, мозговых оболочек или паутинной оболочки. Держите ткань замороженной во время процесса резки, работая быстро и часто, помещая весовую лодку с мозговой тканью в контейнеры из полистирола с сухим льдом.
- Запишите точный вес серого вещества, вырезанного из каждого замороженного кусочка, с помощью аналитических весов. Рассчитайте объем буфера с низким содержанием солей (LS) (см. таблицу 1), необходимого для гомогенизации донца (5 мл/г или 20% по массе).
- Приготовьте 10 мл LS-буфера с 1x коктейлем из протеазы и ингибитора фосфатазы и охладите на льду.
- Снимите взвешенную ткань и весовую лодку с сухого льда и нарежьте кубиками примерно 2 х 2 мм по мере оттаивания. Переложите в предварительно охлажденную пробирку гомогенизатора объемом 2 мл на льду.
- Добавьте 5 мл/г (20% мас./об.) ледяного буфера с низким содержанием соли (LS) с 1X протеазой и коктейлем ингибиторов фосфатазы.
- Гомогенизируйте мозговую ткань на льду, используя примерно 10 ударов пестика А с высоким клиренсом и 15 ударов пестика В с низким клиренсом.
- Переложите весь гомогенат в полипропиленовую пробирку объемом 2 мл с помощью стеклянной пипетки Пастера. Пометьте пробирку буквой «TH» (Total Homogenate), номером тканевой ткани и объемом гомогената. Внесите 0,8 мл в пробирку объемом 1,5 мл. Любой избыток гомогената может быть аналогичным образом аликвотирован и храниться при температуре -80 °C.
- К каждому 0,8 мл аликвоты добавляют по 100 мкл 5 М NaCl и 10% (мас./об.) саркозила до концентраций 0,5 М и 1% мас./об., соответственно. Хорошо перемешайте пробирки путем инверсии и выдержите на льду в течение 15 минут. Пробирки с маркировкой «TH-S» (общий гомогенат-саркозил) указывают на то, что гомогенаты находятся в саркозил-буфере (Таблица 1).
- Обработайте каждую трубку ультразвуком в течение трех импульсов по 5 с амплитудой 30% на льду (максимальная интенсивность = 40%) с помощью зонда с микронаконечником.
- Определение концентраций белков гомогенатов с помощью метода анализа бицинхониновой кислоты (ВСА).
заметка: Средняя концентрация белка гомогенатов TH-S, приготовленных в концентрации 5 мл LS на грамм ткани, составляет 15-20 мг/мл. Гомогенаты могут быть немедленно фракционированы или храниться при температуре -80 °C до использования.
- Разбавьте гомогенаты TH-S до 10 мг/мл с помощью ледяного буфера сарка (Таблица 1) с 1x ингибиторами протеазы и фосфатазы.
- Перенесите 5 мг белка (0,5 мл) каждого гомогената TH-S в ультрацентрифужные пробирки из поликарбоната объемом 500 мкл и спарный баланс с сарк-буфером. Загрузите пробирки в предварительно охлажденный ротор и ультрацентрифугу при давлении 180 000 x g в течение 30 мин при 4 °C. Перенесите растворимые в саркозиле надосадочные жидкости (S1) в пробирки объемом 1,5 мл и храните при температуре -80 °C. <бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: (Дополнительная стирка) Добавьте 200 μL sark-buffer в ультрацентрифужные пробирки, содержащие нерастворимые в моющем средстве фракции (P1), и выбейте гранулы (P1) со дна ультрацентрифужных пробирок с помощью наконечника для дозатора объемом 200 μL.
- Кратковременно импульсно вращайте перевернутые пробирки в течение 2-3 с (≤2 500 x g) на микроцентрифуге, чтобы перенести гранулы (P1) и буфер в пробирки объемом 1,5 мл, расположенные ниже. Ресуспендируйте нерастворимые гранулы (P1) в сарк-буфере путем пипетирования вверх и вниз, чтобы обеспечить разрушение гранул.
- Парный баланс и центрифуга при 180 000 x g в течение дополнительных 30 минут при 4 °C.
- Выбросьте необязательный надосадочный жидкость (S2) и инкубируйте нерастворимые в саркозиле гранулы (P2) в 50-75 мкл буфера мочевины (Таблица 1) с 1x PIC (коктейль ингибиторов протеазы и фосфатазы) в течение 30 минут при комнатной температуре для растворения гранул.
заметка: Перед использованием подогрейте буфер из мочевины до комнатной температуры, чтобы избежать выпадения осадков SDS. Для чувствительных к моющим средствам областей применения исключите SDS из буфера мочевины и рассмотрите возможность промывки нерастворимых гранул (P2) в буфере с низким содержанием соли перед повторной суспендированием в буфере мочевины.
- Перенесите ресуспендированные гранулы (P2) в пробирки объемом 0,5 мл и используйте кратковременную (1 с) ультразвуковую обработку микронаконечника с амплитудой 20% (максимальная интенсивность = 40%) для полной растворимости гранул.
- Определить концентрации белков саркозил-растворимой (S1) и -нерастворимой (P2) фракций с помощью метода анализа БЦА. Используйте эти фракции сразу или храните при температуре -80 °C до использования.
Таблица 1: Список буферов
| 10% w/v раствор саркозила: 10 г N-лаурил-саркозиновой натриевой соли на 100 мл ddH2O (перемешать при RT на ночь) |
| Буфер с низким содержанием солей (LS): 50 мМ HEPES pH 7.0, 250 мМ сахароза, 1 мМ ЭДТА |
| Саркозил (сарк) буфер: LS буфер + 1% (w/v) саркозил + 0,5 М NaCl |
| Буфер для мочевины (хранить при -20 °C): 50 мМ Tris-HCl pH 8,5, 8М карбамид, 2% SDS |