Оценка моторной функции на экспериментальной модели мышей с аутоиммунным невритом

Abstract

Источник: Gonsalvez, D. G., et al., Простой подход к индуцированию экспериментального аутоиммунного неврита у мышей C57BL/6 для функциональных и невропатологических оценок. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео демонстрирует процесс оценки двигательной дисфункции на мышиной модели с помощью введения коклюшного токсина и инокулюма, содержащего миелиновые пептиды и адъюванты, с последующими тестами на беговой дорожке для оценки двигательной функции и оценки результирующего повреждения нервов из-за иммунной активации и демиелинизации.

Protocol

Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.

1. Индукция EAN (экспериментальный аутоиммунный неврит)

ПРИМЕЧАНИЕ: EAN может быть успешно индуцирован у самцов мышей C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель. Всего протокол индукции занимает 9 дней. День 0 относится к дню первой иммунизации. Для этого протокола инъекции проводились под анестезией (см. шаг 1.1.2 ниже).

1. В день -1:
   1. Приготовьте раствор коклюшного токсина (см. Таблицу материалов) в концентрации 1,6 мкг/мл с использованием стерильного 0,1 М мышиного изотонического фосфатно-солевого буфера (MT-PBS).
   2. Обезболивание изофлураном:
      1. Поместите мышь (C57BL/6, самец, 6-8 недель) в камеру анестезии и отрегулируйте поток кислорода до 1 л/мин.
      2. Включите вапорайзер изофлурана, отрегулируйте его на 2,5% для анестезии, следите за дыханием и подождите 2 минуты или пока первичные рефлексы (роговица и задняя конечность) перестанут реагировать.
   3. Извлеките мышь из камеры анестезии и введите 250 мкл вышеуказанного раствора коклюшного токсина путем внутрибрюшинной инъекции с помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой 30_1/2 G.
   4. Подготовьте инъекционный инокулюм к иммунизации:
      1. Приготовьте раствор А, используя 2 мг/мл раствора пептида P0180-199 (с чистотой > 98%, последовательность S-S-K-R-G-R- Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) в 0,9% физиологическом растворе.
      2. Приготовьте раствор В, используя 20 мг/мл раствора Mycobacterium tuberculosis (см. Таблицу материалов) в полном адъюванте Фройнда (FCA, включающий 15% моноолят маннида + 85% парафинового масла и 0,5 мг/мл высушенной убитой и высушенной Mycobacterium butyricum).
      3. Чтобы сделать окончательный инокулюм для инъекций, соедините равные по объему части растворов А и В в бисерной машине и перемешайте их на максимальной скорости в течение 1 минуты при комнатной температуре><. заметка: Растворы А и В можно хранить в качестве запаса и хранить при температуре 4 °C не более одного месяца, но комбинированный окончательный посевной материал должен быть свежим в день инъекции мыши.
2. В день 0 введите 50 мкл инокулюма (препарат, описанный в шаге 1.1.4) мышам путем подкожной инъекции с помощью иглы 23 G.
   заметка: Инъекция может быть введена между лопатками или между задней конечностью и хвостом над хвостовой спинкой.
3. В 1-й день приготовьте раствор коклюшного токсина в концентрации 1,2 мкг/мл (в MT-PBS) и введите 250 мкл мышке путем внутримышечной инъекции с помощью шприца объемом 0,5 мл с иглой 301/2 G.
4. На 3-й день повторите шаг 1.3 выше.
   заметка: Исходные растворы А и В можно готовить и хранить при температуре 4 °C не более одного месяца. Тем не менее, окончательный ввод инъекционного инокулюма, полученного путем соединения исходных растворов А и В, должен быть сделан в день инъекции.
5. На 8-й день введите 50 мкл инокулюма (препарат, описанный в шаге 1.1.4) мышке путем подкожной инъекции (см. шаг 1.2 выше) в том же месте инъекции, что и в шаге 1.2 (для каждого животного)

2. Оценка двигательной функции

ПРИМЕЧАНИЕ: Моторные показатели оцениваются параллельно с клинической оценкой для той же когорты животных. Аппарат для оценки двигательных функций должен быть подключен к компьютеру, на котором установлена система визуализации функции походки (см. Таблицу материалов). Также рекомендуется, чтобы все оцениваемые мыши были приучены к беговой задаче до введения EAN. Для этого за три дня до индукции заболевания (день -3) проводятся тренировочные прогоны (2 пробных прогона на мышь).

1. Включите аппарат для оценки двигательной функции и включите световую кнопку.
2. Плотно загримируйте мышь и нанесите чернила на ее ноги, опустив ее на контейнер, наполненный красными чернилами, держа ее за хвост.
   заметка: Этот шаг является обязательным для штамма C57BL/6, но его можно пропустить, если используется штамм мышей с белым цветом шерсти.
3. Поместите мышь в прогулочный отсек и установите скорость беговой дорожки на уровне 15 см/с.
4. Включите беговую дорожку и нажмите кнопку «запись», чтобы зафиксировать беговое движение мыши с помощью системы визуализации функции ходьбы (см. Таблицу материалов).
5. Используйте таймер и измеряйте каждый бег в течение 36 секунд. Через 36 с остановите запись и остановите беговую дорожку.
   заметка: Мыши, которые не могут успешно выполнить выполняющуюся задачу в течение этого интервала в 36 секунд, считаются неудачными.
6. Сохраните видеофайл в указанной папке.
7. Повторите описанные выше шаги для каждой мыши, которую необходимо оценить. Тестируйте мышей с одной и той же запущенной задачей каждые 3 дня.
8. Анализируйте отредактированные видеофайлы с помощью программного обеспечения для определения параметров функции походки (см. Таблицу материалов).
   заметка: Детали анализа различных параметров двигателя различаются в зависимости от программного обеспечения, поэтому перед анализом обратитесь к инструкциям производителя. В зависимости от конкретных целей исследования, ткани животных могут быть взяты на любом этапе оценки постмоторной функции для получения гистологических доказательств повреждения аксонов и миелина с помощью иммуногистохимии или электронной микроскопии.

Results

Таблица 1: Парадигма клинической оценки EAN.

счёт	критерии	Примечания и комментарии к критериям оценки
0	Обычная мышь
1	Менее живой ИЛИ пенистый	Это оценивается в ответ на нормаль...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, кобель, 6-8 недель	Австралийские биоресурсы Cenre, WA, Австралия
Коклюшный токсин	List Biological Laboratories, Inc., Калифорния, США	#181
0,1М мышиный изотонический фосфатированный буферизованный соленый (MT-PBS)			В лабораториях будет свой протокол.
Изофлуран	Pharmachem, Квинсленд, Австралия		В лабораториях будет свой протокол введения.
Пептид P0180–199	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, последовательность S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Тепло убило Mycobacterium tuberculosis (штамм H37RA)	Difco, MI, США	#231141
Полный адъювант Фройнда (FCA)	Difco, MI, США	#263910
16% параформальдегида (PFA)	Услуги электронной микроскопии	#15710	Разведите до 4% PFA в день сбора ткани.
25% глутаральдхейд	ProSciTech Pty Ltd, Квинсленд, Австралия	#11-30-8	Развести до 2,5% глутаральдегида в день фиксации.
Азид натрия	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Австралия	СЛ189	Создание 10% запасов (w/v) в 0,1M MT-PBS. Используйте при 0,03% (v/v).
сахароза	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Австралия	СА030	Используйте при концентрации 30% (по массе).
Оптимальная температура резания (OCT) среды	Сакура Финетек, Калифорния, США	#4583
Обычная ослиная сыворотка	Merck Millipore, MA, США	#S30-100	Использовать в качестве разбавителя антител в концентрации 10% (v/v) или другой концентрации, определенной в собственной лаборатории.
Тритон-Х 100	Сигма Олдрич, Мичиган, США	#90o2-31-1	Применение в качестве разбавителя антител в концентрации 0,3% (v/v) или другой концентрации, определенной собственной лабораторией.
Кроличий антиамилоидный белок-предшественник (APP)	Инвитроген (Life Technologies), Калифорния, США	С12700	Используется в концентрации 1:400 или титруется в собственной лаборатории.
Кролик антиконтактин-ассоциированный белок-1 (Caspr)	Подарок от профессора Элиора Пелеша, Научный институт Визмана, Израиль		Используется в масштабе 1:500 или титруется в собственной лаборатории.
Подходящие конъюгированные вторичные антитела Alexa Fluor	Молекулярные зонды (Life Technologies), ОР, США	различный	Используйте в концентрации 1:200 или титруйте в собственной лаборатории. Выбор видов, в которых было выращено антитело, и выбор Alexa Fluor остается на усмотрение каждой лаборатории.
Решение для монтажа на водной основе	Dako (Agilent), Калифорния, США	#S3023	У каждой лаборатории будут свои предпочтения.
оборудование
Шприц 0,5 мл с иглами 301/2 г	БД	#326105
23 г игл	БД	#305143
Блокнот с красными чернилами			Для маркировки ног животных можно использовать любую красную чернильную подушечку или красный пищевой краситель.
Аппарат DigiGate (включает беговую дорожку)	eMouse Specifics Inc. Фрамингем, Массачусетс
Система визуализации DigiGate	eMouse Specifics Inc. Фрамингем, Массачусетс
секундомер			Таймер может быть использован любой.
Программное обеспечение DigiGait 8	eMouse Specifics Inc. Фрамингем, Массачусетс
Препарирующий микроскоп	Цейсс		Можно использовать любой подходящий препарирующий микроскоп.
Заряженные горки	Суперфрост Плюс, Ломб Сайентификал Пти Лтд	SF41296SP
Циростат	Лейка		Можно использовать любой подходящий циростат.
Перфузионное оборудование и инструменты для препарирования			В лабораториях будут свои перфузионные протоктолы.
Непрозрачная гумифицированная камера			Лаборатории могут производить свои собственные, используя непрозрачный пластиковый контейнер.
ПАП пене	GeneTex (США)		Восковой карандаш или поверхностное натяжение также могут быть использованы для создания углубления вокруг участка ткани.
Конфокальный микроскоп	Цейс LSM780		Можно использовать любой конфокальный микроскоп с соответствующими лазерными линиями.
ФИДЖИ/Изображение J	Национальные институты здравоохранения		Доступно с www.fiji.sc