$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Сопряжение Gal4- и QF-опосредованной экспрессии трансгена Htt у дрозофилы
- Сбор и/или генерация трансгенных линий Drosophila melanogaster, содержащих тканеспецифичные «драйверы» Gal4 или QF, а также линии, содержащие трансгены дикого типа или мутантные Htt ниже по течению от Gal4-UAS или QF-QUAS. Убедитесь, что белки, экспрессируемые этими трансгенами, слиты с флуоресцентными белками или помечены эпитопами, чтобы обеспечить дифференциацию мутантных и диких продуктов трансгена Htt в одной и той же мухе. Смотрите рисунок 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы используем фрагменты экзона 1 гена Htt человека. Тем не менее, вместо этого могут быть сгенерированы трансгенные мухи для экспрессии более длинных фрагментов Htt или других генов, если это необходимо.
- Планируйте генетическую стратегию таким образом, чтобы мутантные трансгены и трансгены Htt дикого типа экспрессировались в отдельных, неперекрывающихся клеточных популяциях.
- Если произойдет какое-либо перекрытие экспрессии, мутантные белки и белки Htt дикого типа, синтезированные в одних и тех же клетках, будут совместно агрегироваться и предотвращать обнаружение прионоподобных событий. Чтобы избежать этого, используйте специфические репрессоры Gal4 и QF, Gal80 и QS40 соответственно (рис. 1). Выбор драйверов Gal4 и/или QF, контролируемых развитием, может помочь ограничить экспрессию мутантного Htt в постмитотических клетках, исключая возможность того, что деление клеток может способствовать распространению агрегатов от клетки к клетке.
- Используя стандартные условия культивирования, спаривание мух для получения потомства, экспрессирующего мутантный Htt через QF (или Gal4) в популяции клеток-доноров и Htt дикого типа через Gal4 (или QF) в популяции клеток-реципиентов. На рисунке 1 показана схема, показывающая возможную генетическую комбинацию.
заметка: Драйверы QF и Gal4, которые были использованы для получения данных, показанных на рисунках 1-4 и в нашей предыдущей публикации, включают драйвер нейронов обонятельного рецептора DA1 (ORN), Or67d-QF, и панглиальный драйвер, repo-Gal4.
- Генерируйте параллельно контрольные мухи, экспрессирующие Htt дикого типа в популяциях клеток, меченных QF и Gal4.
- Соберите потомство желаемого генотипа и возрастите животных в соответствии с требованиями.
2. Микродиссекция и фиксация мозга взрослых дрозофил
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура препарирования была модифицирована по сравнению с предыдущей публикацией и может быть использована для подготовки мозга к визуализации прямых флуоресцентных сигналов от слияния Htt-флуоресцентных белков.
- Соберите и положите на лед следующие материалы: фосфатно-солевой буфер, содержащий 0,03% Triton X-100 (PBS/T); микроцентрифужные пробирки, содержащие 970 μL 4% фиксирующего раствора параформальдегида (PFA), приготовленного путем добавления 200 μL 20% PFA к 770 μL PBS/T; прозрачную стеклянную чашку, содержащую лунку; одноразовую передаточную пипетку; два рассекающих щипца (один No 3 и один No 5).
- Обезболите взрослых мух с помощью CO2 и перенесите их в одну лунку стеклянной посуды на льду.
- С помощью передаточной пипетки добавьте небольшое количество (~ 500 мкл) холодного PBS/T в лунку, содержащую мух, и в пустую лунку. Избегайте введения слишком большого количества пузырьков, так как они могут помешать рассечению.
- Поместите стеклянную чашку на плоскую поверхность под препарирующим микроскопом и регулируйте увеличение до тех пор, пока тело мухи не заполнит поле зрения и не окажется в фокусе.
- Расположите пару источников света на гусиной шее так, чтобы свет освещал обе стороны стеклянной посуды. Закрепите сложенную лабораторную салфетку под стеклянной чашкой, чтобы отбросить части тела/кутикулу во время вскрытия.
- Используя щипцы No 3 в недоминантной руке, перенесите одну муху в лунку, содержащую PBS/T. Обездвижите муху, взявшись за ее брюшную полость брюшной стороной вверх.
- Полностью погрузив муху в PBS/T, удалите головку мухи с помощью щипцов No 5 в доминирующей руке. Введите один кончик этих щипцов под кутикулу в небольшом пространстве, прилегающем к хоботку с одной стороны головки мухи. Закрепите захват на голове, сжимая щипцы, чтобы захватить глаз с обеих сторон.
- Извлеките голову мухи из тела, раздвинув два щипца. Утилизируйте тело мухи на лабораторной салфетке, расположенной неподалеку. Поддерживайте давление на щипцы доминирующей руки, чтобы головка мухи не была потеряна.
- Расположите один кончик щипцов No 3 в недоминантной руке в том же небольшом пространстве под кутикулой с другой стороны хоботка. После этого сожмите щипцы, чтобы захватить глаза в одном и том же месте с обеих сторон головы.
- Как только захват кутикулы будет надежно закреплен, осторожно раздвиньте щипцы на 180°. Это действие позволит разорвать кутикулу головки, не повреждая мозг. Выбросьте остатки кутикулы с лабораторной салфетки.
- Несмотря на идеальность, кутикула головы может быть не полностью удалена за один прием. В этом случае удаляйте кутикулу по частям до полного обнажения мозга. Следите за тем, чтобы не повредить мозг, избегая прямого контакта с щипцами.
- Извлеките рассеченный мозг из PBS/T, взявшись за прикрепленную трахею, или путем аспирации мозга в пространство между кончиками щипцов с помощью капиллярного воздействия.
заметка: Удаление трахеи не является обязательным, так как оно, как правило, не заслоняет доли антенн на передней поверхности мозга, где мы обычно делаем изображения. Однако, если трахеи мешают визуализации, удалите их осторожно, чтобы мозг не был поврежден этой манипуляцией.
- Перенесите мозг мухи в одну из микроцентрифужных пробирок, содержащих фиксирующий раствор на льду. Убедитесь, что мозг отделился от щипцов и погружен в фиксирующий раствор.
- После того, как все мозги будут препарированы, подвергните их «короткому исправлению», поместив закрытые трубки на нутатор на ~ 5 минут при комнатной температуре в темно><те.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот короткий этап фиксации гарантирует, что мозг легче обрабатывается на последующих этапах и не прилипает к стенкам микроцентрифужной трубки.
- Удалите большую часть фиксирующего раствора с помощью пипетки P1000 и выбросьте его.
- Избегайте всасывания мозгов из трубки во время этого и любого последующего этапа промывки. Установите P1000 на меньший объем (например, 650 μл) и удалите надосадочную жидкость в два этапа. Кроме того, держите микроцентрифужные трубки на одной линии с источником света (например, верхним светом) во время аспирации, чтобы лучше визуализировать мозг.
- Добавьте 1 мл свежего PBS/T в мозги. Быстро промыть (< 1 минуту) в темноте, отсадить надосадочную жидкость из мозга и выбросить.
- Повторите стирку с PBS/T в темноте при комнатной температуре по следующему графику: 2 быстрые (< 1 мин) стирки, 1 X 5 мин, 3 X 20 мин и 1 X 1 ч стирка. Закрепите крышки на микроцентрифужных пробирках и поместите пробирки на нутатор между промывками.
- Если требуется окрашивание DAPI, замените заключительную промывку в течение 1 часа на 1 X 30 мин инкубации с 250 нг/мл DAPI, разведенным в PBS/T, после чего следует 2 быстрые стирки и 1 x 20 мин.
- После последнего промывания удалите большую часть надосадочной жидкости буфера промывки, стараясь не беспокоить мозг, и добавьте в мозг 30 μл реагента против выцветания на основе глицерина. Инкубировать при температуре 4 °C в темноте без движения не менее 1 ч и не более 24 ч.
3. Крепление всего мозга
- Поместите предметное стекло для стеклянного микроскопа под препарирующий микроскоп и пометьте его идентификационной информацией.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, мозг может быть установлен непосредственно на защитное стекло для доступа к обеим сторонам мозга во время визуализации. Ранее был опубликован протокол, описывающий эту процедуру монтажа45.
- Удалите мозги из каждой микроцентрифужной пробирки с помощью затупленного наконечника пипетки (подготовленного с помощью бритвенного лезвия для удаления дна ~ 1 см от наконечника объемом 1-200 мкл) и перенесите их в середину предметного стекла. Переносите как можно меньше реагента против выцветания в мозг.
- Используйте щипцы для позиционирования мозга в желаемой ориентации (например, тыльной стороной к верхней части предметного стекла и передней поверхностью вверх для визуализации доли антенны). При ориентации мозга учитывайте световой путь микроскопа, который будет использоваться для его визуализации.
- Удалите излишки реагента против выцветания со предметного стекла с помощью заостренного угла сложенной лабораторной ткани, не повреждая мозг. Дайте слайду постоять ~ 5-10 минут в темноте, чтобы мозг мог прилипнуть к слайду.
- Окружите мозги мухи четырьмя маленькими кусочками разбитого покровного стекла, расположенными с каждой стороны мозга, чтобы сформировать квадрат размером ~ 19 мм x 19 мм. Поместите один край покровного стекла 22 мм x 22 мм No 1,5 рядом с одним из этих маленьких кусочков стекла и осторожно опустите покровное стекло на мозги, чтобы завершить крепление моста.
- Медленно нанесите свежий реагент против выцветания, чтобы заполнить поверхность под покровным стеклом, стараясь не повредить покровное стекло или мозг. Сотрите излишки антивыцветания с помощью заостренного угла сложенной лабораторной салфетки, не касаясь покровного стекла напрямую.
- Добавьте по капле прозрачного, быстросохнущего лака для ногтей на каждый из четырех углов покровного стекла. Дайте высохнуть ~ 10 минут. Затем заклейте четыре края покровного стекла лаком для ногтей, чтобы полностью закрыть мозги.
- Сфотографируйте мозг сразу или храните при температуре 4 °C до готовности.
- Если вы визуализируете собственную флуоресценцию от слияния Htt-флуоресцентных белков, визуализируйте мозг в течение 24 часов для получения наилучшего сигнала.
4. Визуализация и количественная оценка прионной передачи агрегатов
- Визуализируйте смонтированный мозг с помощью конфокального микроскопа, оснащенного масляным объективом 40X или 60/63X, для сбора изображений z-среза через область мозга, где экспрессируются выбранные драйверы Gal4 и QF (рис. 2A, B).
- Возбуждайте слияния флуоресцентных белков или иммуномеченых белков с помощью соответствующих лазеров (например, 488 нм для GFP/YFP/FITC или 552 нм для mCherry/Cy3). Установите окна обнаружения, которые захватывают максимальный флуоресцентный сигнал и устраняют перекрестные помехи в канале, используя либо систему спектрального обнаружения, либо полосовые/длинночастотные фильтры излучения, специфичные для каждого флуорофора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны при визуализации белковых агрегатов. Пиксели в центре каждого агрегата легко насыщаются, особенно в более крупных агрегатах. Попытайтесь свести к минимуму насыщенность изображения, но помните о риске потери сигнала от более мелких агрегированных частиц (рис. 2B, C, D). Слишком большая насыщенность приведет к увеличению фона изображения, что затруднит выявление отдельных точек. Протестируйте различные настройки изображения для оптимизации перед получением окончательных изображений в каждом наборе данных.
- Анализируйте данные путем количественной оценки отдельных точек либо вручную, перемещаясь по отдельным z-срезам (например, Рисунок 2C и Рисунок 4A), либо после рендеринга конфокальных срезов в трех измерениях (Рисунок 3A, B).
заметка: Это можно сделать в Image J или другом программном обеспечении для обработки изображений.
- Если агрегаты хорошо разделены и фоновая флуоресценция минимальна, используйте программное обеспечение для анализа изображений для систематической идентификации, количественной оценки и анализа агрегатов как отдельных «объектов» или «поверхностей» в 3D-реконструкции конфокального стека (рис. 3B).
заметка: Описанные действия программного обеспечения относятся к используемому здесь инструменту и программному обеспечению (см. Таблицу материалов).
- Визуализируйте конфокальную z-серию в режиме 3D-просмотра. Используйте мастер "Анализ" для определения отдельных пятен в выбранном канале (например, красный канал для агрегатов HttQ91-mCherry на рисунке 3). Настройте пороговые значения и фильтры, чтобы точно представить все агрегаты неоднородного размера в виде отдельных объектов на изображении.
- Включите параметр «Разделить объекты» в разделе «Предварительный фильтр двоичной обработки», чтобы разделить тесно связанные агрегаты, которые аберрантно объединены программным алгоритмом. Обратите внимание, что общее количество объектов и связанные с ними измерения отображаются в разделе "Измерения".
заметка: Этот метод количественного определения мутантных агрегатов Htt не поддается протоколу иммуноокрашивания, поскольку центр амилоидных агрегатов непроницаем для антител. В результате агрегаты появляются на микроскопе в виде кольцеобразных структур, а программное обеспечение для анализа изображений не в состоянии точно идентифицировать и различить эти отдельные «пятна».
- Количественно оценивайте агрегаты Htt дикого типа, вручную перемещаясь по z-стеку и оценивая агрегаты Htt дикого типа, гарантируя, что агрегаты не будут дважды оценены, если они появляются более чем в одном срезе (рис. 4A).
заметка: Этот подход к ручному количественному определению может быть использован в тех случаях, когда количество агрегатов в каждом конфокальном стеке является разумным (например, 20-50). Это также полезно, когда программное обеспечение для анализа изображений не может отличить отдельные точки от окружающего сигнала в том же канале (например, сигнал от диффузного Htt дикого типа в соседних ячейках) (рис. 2B, C и рис. 4A). Количественная оценка агрегатов Htt дикого типа также может быть сложной задачей, потому что многие нормальные структуры в мозге кажутся пунктированными (например, клеточные процессы и синапсы). В качестве критерия отбора может быть использована колокализация сигналов дикого типа и мутантных сигналов HTT; однако возможно, что некоторые мутантные «семена» Htt падают ниже предела обнаружения конфокала. Белок, отличный от HTT, который не агрегируется в клетках-реципиентах (например, GFP), может быть использован для маркировки неродственных точечных структур в мозге.
- Используйте программное обеспечение для анализа изображений для дальнейшей характеризации отдельных агрегатов. Например, определить распределение агрегатов по размерам (рисунок 3C), процент колокализации между мутантными и дикими белками Htt (рисунок 4A) или напрямую измерить белок-белковые взаимодействия с помощью FRET (рисунок 4B).
- Определите распределение отдельных точек по размерам с помощью алгоритма обнаружения пятен или поверхностей, который точно идентифицирует все видимые агрегаты в определенном канале. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для проведения соответствующих измерений пятен или поверхностей, например, получите информацию о «совокупном диаметре» (рис. 3C), «объеме» или «интенсивности» из раздела «Измерения» в мастере «Анализ» программного обеспечения, описанном в шаге 4.2.1.
заметка: На рисунке 3C показано распределение диаметров для всех точек HttQ91-mCherry, идентифицированных в одном клубочке DA1.
- Определите процент колокализации между агрегатами HttQ25-YFP и HttQ91-mCherry, вручную перемещая срез за срезом через конфокальный z-стек (наиболее точный метод). Однако следите за тем, чтобы не считать агрегаты дважды. Чтобы предотвратить это, подсчитывайте агрегаты в конкретном z-срезе только в том случае, если плоскость фокуса проходит через центр агрегата (рис. 4A).
- Рассчитайте эффективность FRET для индуцированных агрегатов HttQ25-YFP с колокализованным сигналом HttQ91-mCherry с использованием метода акцепторного фотообесцвечивания.
- Во-первых, устраните потенциальные перекрестные помехи между каналами YFP и mCherry, установив окна обнаружения для сигналов, предназначенных только для mCherry и только для YFP, которые не производят сигнал в другом канале. Используя эти настройки, сделайте «до» изображение отдельных точек HttQ25-YFP и связанного с ними сигнала HttQ91-mCherry (рис. 4B).
- Затем отбелите сигнал mCherry, отрегулировав красный лазер (например, 552 нм) до 100% интенсивности, и сканируйте до тех пор, пока сигнал не исчезнет. Вернитесь к настройкам, использованным для «изображения до», и сделайте «изображение после» той же точки (рис. 4B).
- Рассчитывайте измерения интенсивности флуоресценции для каждой точки до и после фотообесцвечивания с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
- Рассчитайте эффективность FRET путем вычитания донорной флуоресценции YFP, измеренной на «предварительном изображении» (YFPinitial), из флуоресценции донора YFP на «послеобразном изображении» (YFPfinal). Разделите это значение на YFPfinal и умножьте на 100,
заметка: Эффективность FRET может быть рассчитана попиксельно или в целом для каждого агрегата HttQ25-YFP (рис. 4B). Акцепторное фотообесцвечивание является особенно полезным методом для расчета эффективности FRET, когда сигнал mCherry, связанный с каждой точкой HttQ25-YFP, достаточно высок для получения обнаруживаемого гашения YFP после фотообесцвечивания mCherry.
