Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка мыши к операции
- Достаньте мышь из домашней клетки и взвесьте (г).
- Поместите мышь в индукционную камеру изофлурана и установите кислород на 2 л/мин, а испаритель изофлурана на 5, чтобы вызвать хирургическую плоскость анестезии, примерно на 3-5 мин. Контролируйте замедленное дыхание и иммобилизацию. Убедитесь, что мышь полностью усыплена, используя рефлекс щипкового пальца ноги.
- Когда мышь полностью успокоится, поместите ее в стереотаксическую рамку, а носик закрепите в носовом конусе, который прикреплен трубкой к изофлурану. Вставьте ушные планки в ушной канал и затяните, обеспечив устойчивость головы.
- Брейте голову от уха до уха и от промежутка глаз до заушей.
- Простерилизовать кожу чередующимися салфетками изопропилового спирта и раствора бетадина йода, по 3 раза каждая.
- Нанесите искусственные слезы на оба глаза, чтобы предотвратить их высыхание во время хирургической процедуры.
2. Хирургическая процедура
- Следите за глубиной анестезии, зажимая палец ноги или хвост. Мышь находится в соответствующей операционной плоскости, когда нет ответа и дыхание медленное и равномерное.
- Сделайте парасагиттальный разрез кожи от сразу за глазами почти между ушами одним твердым движением с помощью лезвия скальпеля No 11. Отодвиньте кожу в сторону и зафиксируйте правую сторону гемостатом.
- Очистите череп от вышележащей мембраны с помощью тупой стороны скальпеля No 11 и аппликаторов с ватным наконечником. По желанию протрите череп аппликатором с ватным наконечником, смоченным в 0,9% физиологическом растворе. Дайте полностью высохнуть.
- С помощью небольшой линейки отметьте постоянным маркером переднюю границу трепанации черепа на расстоянии 1 мм каудально от коронарного шва и левый край трепанации черепа на расстоянии 1 мм латерально от сагиттального шва (рис. 1). Затем отметьте правую и каудальную границы трепанации черепа на расстоянии 4 мм от сагиттального и коронального швов соответственно (рисунок 1).
- С помощью сверла диаметром 0,5 мм начните делать трепанацию черепа, медленно сверлив по контуру постоянного маркера. Следите за тем, чтобы не пробить череп полностью. Осторожно надавите на изолированный кусочек теменной кости щипцами No 5, слабые участки уступят место давлению. Когда истонченная кость достаточно слаба по всему периметру, костный кусок готов к удалению.
заметка: Если исследователь испытывает трудности с удалением кости целиком, это говорит о том, что кость не была достаточно истончена во время сверления. Рассмотрите возможность дальнейшего сверления черепа у последующих животных, чтобы облегчить удаление части кости.
- С помощью шприца объемом 10 мл с иглой 23 G нанесите небольшое количество 0,9% физиологического раствора, чтобы пропитать изолированную кость и просверленную область.
- Прикрепите руку манипулятора к стереотаксическому оборудованию. Прикрепите новое лезвие скальпеля No 11 к держателю щупа острой стороной лезвия рострально.
заметка: Хотя ростральные и каудальные ткани испытывают острые и тупые края лезвия соответственно, механические повреждения, вызванные проникающей травмой, сопоставимы по всей степени поражения. Мы не наблюдаем заметных различий в основных признаках реактивного глиоза, включая повышение экспрессии или пролиферацию GFAP, между ростральным и каудальным отделами.
- Не мешая руке манипулятора, осторожно приподнимите изолированную кость с помощью щипцов под углом 5/45. Вставьте кончик щипцов в сторону изолированной кости и поднимите, используя рычаг, чтобы одним полным движением оторвать оставшийся кусок кости.
заметка: Будьте осторожны, чтобы не проколоть мозг и не потревожить твердую мозговую оболочку под черепом.
- Возьмите небольшой кусочек смоченной рассасывающейся гелевой пены и положите его на открытый мозг, чтобы предотвратить его высыхание и впитать кровь, которая может присутствовать.
- Как только гелевая пена будет на месте, поверните руку манипулятора на место и отрегулируйте лезвие к центру трепанации черепа над гелевой пеной. Снимите гелевую пену и опустите лезвие до тех пор, пока кончик не коснется твердой мозговой оболочки, не прокалывая твердую мозговую оболочку. Отметьте дорсальные/вентральные координаты с помощью нониусной шкалы на вертикальном плече стереотаксика.
- С помощью руки манипулятора медленно опустите лезвие ровно на 3 мм в мозг. Это достигается за счет использования маркировки шкалы нониуса на руке манипулятора. Оставьте лезвие на месте на 5-10 секунд. Переместите стереотаксический рычаг с прикреплением лезвия рострально к каудальному три раза, позволяя лезвию достичь ростральной и каудальной границ трепанации черепа, прежде чем перейти к противоположному концу.
заметка: Твердая мозговая оболочка не удаляется перед установкой лезвия. В отличие от твердой мозговой оболочки крысы, толщина которой составляет ~80 мкм7, твердая мозговая оболочка мыши значительно тоньше (толщина всего в несколько слоев клеток) и не оказывает заметного сопротивления лезвию скальпеля при введении. Используйте новое лезвие скальпеля для каждой мыши, чтобы гарантировать, что каждое животное получит постоянную травму.
- Медленно поднимите стереотаксическую руку, извлекая лезвие из мозга. После снятия лезвия немедленно поместите еще один кусочек гелевой пены на поверхность мозга, чтобы впитать лишнюю кровь или жидкость.
- Тем временем снимите стереотаксический рычаг и утилизируйте лезвие скальпеля No 11. Как только кровотечение остановится, удалите гелевую пену.
- Закройте рану, зашив кожу нерассасывающимися нитями, такими как этилон или пролен. Швы должны быть сняты через 9-10 дней после операции.
- Верните мышь в домашнюю клетку и дайте ей медленно восстановиться на грелке и следите за любыми признаками расстройства. Восстановление после анестезии, вызванной изофтораном, обычно происходит в течение 2-5 минут после удаления изофторана. Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не восстановит лежачее положение на грудине.
- Введите 0,5-1 мл раствора лактата Рингера подкожно для обеспечения увлажнения.
