Оценка бактериальной колонизации в мозге мыши после инфекции Listeria monocytogenes

Аннотация

Источник: Ghosh, P., et al., Listeria monocytogenes Infection of the Brain. J. Vis. Exp. (2018)

Это видео демонстрирует количественную оценку инфекционной бактериальной нагрузки от перфузированного мозга мыши, зараженного Listeria monocytogenes.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Извлечение органов и определение бактериальной нагрузки

1. После перфузии извлекают органы (например, печень, селезенку) путем тщательного удаления любых прикрепленных сосудов и связок и помещают органы отдельно в стерильную коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл стерильного холода (4 °C) PBS. Храните образцы на льду до тех пор, пока не произойдет дальнейшая обработка.
2. Чтобы извлечь мозг, отрубите ножницами голову за ушами и разрежьте кожу головы между глазами животного по средней линии. Если требуется, обрежьте лишнюю ткань, прижимая ножницы к черепу.
   1. Аккуратно введите один кончик ножниц в большое затылочное отверстие (отверстие в основании черепа, через которое проходит спинной мозг) и разрежьте его в боковом направлении в черепе с обеих сторон.
   2. Аккуратно разрежьте череп между глазами грызуна по средней линии, оказывая боковое давление. Избегайте возмущения мозга и поддерживайте минимальный контакт между мозговой тканью и ножницами.
   3. С помощью щипцов с тонким наконечником откройте череп, чтобы обнажить мозг, и поместите шпатель между нижней стороной мозга и основанием черепа, чтобы удалить мозг.
      заметка: Это приводит к разрыву нервных волокон головного мозга.
   4. Осторожно перенесите мозг в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл стерильного холодного PBS.
   5. Выбросьте тушку мыши и повторите эти действия для остальных животных.
      заметка: После того, как все органы будут извлечены, очистите область процедуры и подготовьтесь к гомогенизации органов для определения бактериальной нагрузки.
3. Очистите и простерилизуйте наконечник тканевого гомогенизатора, помещенного в биобезопасный шкаф, вставив наконечник и запустив гомогенизатор в течение 10 с последовательно в 5% отбеливателе, стерильной воде, 75% этаноле и стерильной воде, каждый из которых содержится в отдельной конической пробирке объемом 15 мл.
4. Гомогенизируйте инфицированный мозг (~20 с при настройке 6, максимальные обороты в минуту) в конической трубке объемом 15 мл до тех пор, пока не останутся видимые фрагменты ткани.
   1. Очистите гомогенизатор, как описано в шаге 1.3, чтобы предотвратить перенос бактериального загрязнения на следующий образец органа.
   2. Выполните процесс гомогенизации для всех остальных органов (например, печени, селезенки).
   3. После завершения процесса гомогенизации очистите гомогенизатор, как описано в шаге 1.3, и храните его до дальнейшего использования.
5. Приготовьте 10-кратные серийные разведения гомогенатов органов в стерильном PBS и нанесите разведения на пластины BHI агара/стрептомицина для определения КОЕ на орган.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичный метод проводится для определения КОЕ на мл крови.
   1. После того, как все разведения будут покрыты, перенесите планшеты в инкубатор с температурой 37 °C на ночь.
   2. На следующий день подсчитайте количество колоний на каждой пластине, чтобы определить общее количество бактерий на орган или мл крови следующим образом:
      КОЕ/орган = (количество колоний х фактор разведения) / мл гомогенатного покрытия x 5<бр /> КОЕ/мл крови = (число колоний х фактор разведения) / мл крови

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Инфузионная среда для мозга и сердца	Бектон Дикинсон	No 237200
Стрептомицина сульфат	Амреско	0382-50Г
Чашки Петри	ВВР	25384-342 (Английский)
глицерин	ВВР	97062-832 (английский)
IKA T18 ULTRA-TURRAX Базовый гомогенизатор	ИКА	3352109	Модель: T18BS1
спектрофотометр	Бекман Коултер	Серия DU 800
BALB/c мыши	Лаборатория Джексона	Модель #000651
Этилендиаминтетрауксусная кислота	Сигма-Олдрич	Номер 60004
Конические тубы 15 мл	ВВР	21008-918 (Английский)
Фосфатно-солевой буфер	Корнинг	46-013-СМ
Шпатель из нержавеющей стали	ВВР	82027-520
Ножницы из нержавеющей стали (4,5 дюйма)	ВВР	82027-578
Щипцы с тонким наконечником из нержавеющей стали (6 дюймов)	ВВР	82027-406