$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Протокол иммунофлуоресценции
- Диссекция тканей
- Принесите в жертву рыбок данио, погрузив их в ледяную воду (5 частей льда / 1 часть воды, 4 °C); оставьте их до тех пор, пока они не прекратят всякое движение, чтобы обеспечить смерть от гипоксии.
- Снимите головку лезвием бритвы. Удалите мягкие ткани с вентральной стороны черепа с помощью щипцов. Вскрыть череп и удалить кость с вентральной стороны мозга. Удалите кожу и кости черепа с дорсальной стороны мозга. Удалите мозг.
- Фиксация тканей
- Фиксация мозга путем погружения на 3 ч в 4% параформальдегид (PFA) при 4 °C.
- Приготовьте 0,1 М фосфатный буфер (PB) путем растворения 1,755 г2PO4H2O и 4,575 г Na2HPO4 в 450 мл дистиллированной воды (dH2O) и доведите до pH 7,4 с необходимым количеством NaOH 1N.
- Приготовьте 4% ПФА, растворив 4 г ПФА в 100 мл 0,1 М ПБ (рН 7,4) путем перемешивания на нагревательной пластине. При достижении температуры 60 °C добавьте 2-4 капли NaOH 1N для получения прозрачного раствора. Оставляют PFA 4% при комнатной температуре (RT) и контролируют рН. Отрегулируйте pH до 7,4.
заметка: Время фиксации зависит от размера тканей. Фиксация тканей в течение более 4–6 ч может привести к сверхфиксации, которая маскирует антигены и ограничивает связывание антител с эпитопами.
- Встраивание тканей
- Прополощите салфетки 3 раза по 5 минут каждая, с 0,1 М PB (pH 7,4).
- Для криопротекции перенесите в ткани 20% сахарозу в PB (0,1 М, pH 7,4) и выдержите в течение ночи при температуре 4 °C. Затем перенесите салфетки в 30% сахарозы в 0,1 М PB (pH 7,4) и выдержите еще на ночь при температуре 4 °C.
- Внедрите ткани в блок компаунда с оптимальной температурой резки (OCT). Для этого приготовьте небольшой дьюар из жидкого азота, возьмите алюминиевую фольгу, и разрежьте ее пополам, чтобы получилась кастрюля. Чашка, содержащая ткани, заполненные соединением ОКТ, должна быть погружена в жидкий азот до тех пор, пока соединение ОКТ не остынет. Замороженные ткани можно хранить при температуре -80 °C до разрезания.
- Резка тканей
- Замороженные тканевые блоки перенести в криостат при температуре -20 °C и разрезать на корональные или сагиттальные срезы по 10 мкм.
- Соберите ткани поочередно последовательными срезами на предметные стекла, подходящие для иммуногистохимии, и храните их при температуре -20 °C до использования.
заметка: Храните слайды при температуре от -20 °C до 4 °C в темной коробке для слайдов или книге слайдов.
- Блокирование неспецифических сайтов связывания и пермеабилизация тканей
- Разграничьте участок ткани на предметном стекле с помощью ручки, устойчивой к растворителям.
- Промойте секции 3 раза в течение 5 минут каждая, с 0,1 М PB (pH 7,4).
- Инкубируют участки с 1% нормальной сывороткой осла, растворенной в буфере для пермеабилизации PB-Triton X-100 0,3% (PB-T), в течение 30 мин при ОТ для проникновения в клеточную мембрану и блокирования неспецифических сайтов связывания.
- Приготовьте Triton X-100 0,3% растворив 0,3 мл Triton X-100 в 100 мл 0,1 М PB (pH 7,4).
- Приготовьте блокирующий раствор, растворив 1% нормальной ослиной сыворотки в PB, содержащей 0,3% TritonX-100,
заметка: Животные виды сыворотки, используемой для проникновения и блокирования буферов, зависят от хозяина вторичного антитела.
- Инкубация со смесью первичных антител
- Промойте секции 3 раза в течение 5 минут каждая, с 0,1 М PB (pH 7,4).
- Инкубируйте срезы в течение ночи во влажном боксе в режиме ЛТ со смесью первичных антител, разведенных в PB-T. Можно использовать следующие смеси первичных антител: козье антитело против орексинового рецептора (OX-2R) разведенное 1:100/кроличьи антитела против каннабиноидного рецептора (CB1R) разведенное 1:100, или козье антитело против пептида орексина (OX-A) разведенное 1:100/кроличьи антитела против CB1R разведенные 1:100.
- Инкубация со смесью вторичных антител
- Промойте секции 3 раза в течение 5 минут каждая, с 0,1 М PB (pH 7,4).
- Инкубируйте срезы в течение 2 ч при ЛТ: 1) смесью конъюгированного вторичного антитела Alexa Fluor 488 против коз и конъюгированного вторичного антитела Alexa Fluor 594 против козы осла, разведенного в соотношении 1:100 в PB-T; или 2) смесь конъюгированного вторичного антитела Alexa Fluor 488-против козы и конъюгированного вторичного антитела против кролика Alexa Fluor 594, разведенного в соотношении 1:100 в PB-T.
заметка: Используйте вторичные антитела, выработанные у того же животного-хозяина. Нормальная сыворотка должна принадлежать к одному и тому же виду вторичных антител (например, использовать вторичные антитела, выработанные в осле и нормальной сыворотке осла). Разбавлять первичные и вторичные антитела блокирующим буфером, содержащим детергент, для увеличения проникновения клеток и снижения фона.
- Тканевый монтаж
- Промойте секции 3 раза в течение 5 минут каждая, с 0,1 М PB (pH 7,4).
- Противозаваривать срезы ядерным красителем DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндолом) приготовленным, растворяя 1,5 мкл DAPI (1 мг/мл) в 3 мл ПБ.
- Покровные направляющие с монтажным материалом (см. Таблицу материалов). Эта водная монтажная среда стабилизирует образец ткани и окрашивает при длительном использовании. Флуоресцентные образцы можно хранить в темноте при температуре 4 °C. Чтобы продлить срок службы флуорофоров, используйте монтажную среду с защитой от выцветания.
заметка: Выберите хорошую крепежную среду. Одним из наиболее важных параметров монтажных агентов является показатель преломления (nD), который должен составлять около 1,5, показателя преломления стекла. Используемая здесь монтажная среда может быть использована, в частности, с образцами, подготовленными для определения ферментов и липидов (т. е. с образцами, которые не должны быть обезвожены восходящим рядом спирта).
- рычаги управления
- Повторите разделы 1.1–1.8, опустив первичное или вторичное антитело или заменив на конкретном этапе первичную или вторичную антисыворотку на PB (отрицательный контроль).
- Повторите разделы 1.1–1.8, предварительно абсорбируя каждое первичное антитело с избытком относительного пептида (100 мг пептида/1 мл разведенной антисыворотки).
- Повторите разделы 1.1–1.8 на срезах мозга мыши (положительный контроль).
заметка: Подготовьте все буферы свежими, незадолго до начала. Тщательно удаляйте излишки жидкости на каждом этапе с помощью пипетки или фильтровальной бумаги вокруг секций, всегда поддерживая срез влажным.