Изучение проникновения FITC и FITC-ферритина с помощью модели гематоэнцефалического барьера in vitro

Аннотация

Источник: Fiandra, L., et al. In Vitro проникновение фарритинов, загруженных FITC, через гематоэнцефалический барьер крысы: модель для изучения доставки наноформулированных молекул. J. Vis. Exp. (2016).

Это видео демонстрирует метод изучения проникновения через модель гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) in vitro с использованием астроцитов и эндотелиальных клеток на мембранной вставке со свободным FITC и ферритином, загруженным FITC. FITC-ферритин связывался с рецепторами на эндотелиальных клетках и проникал через мембранный барьер в нижнюю камеру, в то время как свободный FITC демонстрировал ограниченное проникновение и оставался в верхней камере.

Протокол

1. Создание модели BBB

Примечание: Для создания модели гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) мы предлагаем использовать коммерчески доступные первичные микрососудистые эндотелиальные клетки мозга крысы (RBMECs) и кортикальные астроциты крысы (RCA). Все этапы должны выполняться с использованием стерильных реагентов и одноразовых материалов, работающих в ламинарном проточном колпаке.

1. Клеточная культура
   1. Покрывайте колбы с клеточными культурами поли-L-лизином 100 мкг/мл (1 ч при комнатной температуре, RT) или фибронектином 50 мкг/мл (1 ч при 37 °C) для стимулирования прикрепления RCA или RBMECs соответственно. Затем разморозьте 1 x 10⁶ RCA и 5 x 10⁵ RBMEC в среде эндотелиальных клеток, добавив 5% фетальную бычью сыворотку, 1% добавку для роста эндотелиальных клеток и 1% пенициллин/стрептомицин (sECM). Засейте RCA в колбе T175 по 20 мл sECM и RBMEC в колбе T75 по 10 мл sECM.
      Примечание: Проходы размораживания и посева RCA и RBMEC должны быть скорректированы с точки зрения плотности клеток и времени в культуре в соответствии с количеством экспериментальных условий, которые должны быть протестированы с помощью модели BBB. Начав с 1 флакона 1 x 10⁶ RCA и 1 флакон 5 x 10⁵ RBMEC, можно получить до 20 вкладышей BBB.
   2. Поддерживайте клетки при температуре 37 °C и 5%_CO2 во влажной атмосфере в течение примерно 6 дней до примерно 80% слияния для RCA и более 90% для RBMECs. Отделить клетки с помощью раствора трипсин-этилендиамина тетрауксусной кислоты (трипсин-ЭДТА) (трипсин 1:250) в течение 5 мин (1 мл трипсина для колб Т75 и 2 мл для колб Т175). Прекратите активность трипсина с помощью sECM (2:1), центрифугируйте суспензии клеток в дозе 750 × г в течение 5 мин и повторно суспендируйте гранулы в 60 мл sECM.
   3. Разделите RBMEC на 3 колбы T175 и заквашивайте в sECM еще 3 дня перед посевом на вкладыши. Подсчитайте общее количество живых RCA, наблюдая за клеточной суспензией, разбавленной трипановым синим в соотношении 1:1, под оптическим микроскопом в камере Беркера.
2. Посев ячеек на пластины
   1. Обработайте одну сторону мембраны из полиэтилентерефталата (ПЭТ) из 6 многолуночных прозрачных вставок поли-L-лизином 100 мкг/мл, а другую сторону фибронектином 50 мкг/мл, чтобы обеспечить присоединение RCA и BMEC. Обрабатывайте вставки пинцетом во избежание контакта с ПЭТ-мембраной.
      1. Поместите вкладыши в 6-луночную пластину и добавьте раствор фибронектина (минимум 500 мкл) в верхнюю камеру. После 1 часа инкубации при 37 °C извлеките раствор фибронектина, снимите вкладыши с многолуночной пластины и положите их вверх дном на чашку Петри высотой 150^см2, которая используется здесь в качестве стерильной опоры для уже покрытых слоем вкладышей.
      2. Аккуратно добавьте 800 мкл поли-L-лизина на нижнюю сторону вкладыша (как показано на рисунке 1A; это называется затравкой RCAs) и держите раствор на вкладышах в течение 1 часа при RT.
      3. Отсадите раствор и дайте вставкам высохнуть при RT в течение 15-30 минут. Теперь вкладыши готовы к засеву в ячейки, но также могут храниться в многолуночной пластине в течение нескольких дней при температуре 4 °C><, прежде чем приступить к изготовлению BBB. Примечание: Не забывайте держать как минимум 3 вставки с покрытием вне ячеек, которые будут использоваться в качестве контроля для валидации укоренения ГЭБ при измерениях потока FD40.
   2. Засейте RCA (35 000/^см2) на нижнюю сторону вставок, покрытых поли-L-лизином, капнув 800 мкл клеточной суспензии на перевернутую вставку. Оставьте суспензию RCA на вкладышах на 4 часа в режиме RT, чтобы обеспечить эффективное прикрепление клеток к мембране.
   3. Отсадите остаточный раствор, поместите вкладыши в лунки, содержащие 2 мл sECM, и поддерживайте температуру многолуночного планшета на уровне 37 °C и 5%_CO2 в увлажненной атмосфере, меняя sECM каждые 2 дня.
   4. Через 3 дня, когда RCA покроют нижнюю поверхность вставки, нанесите RBMEC на верхнюю сторону вставки, выполнив следующие действия:
      1. Отделите RBMEC от колб T175 и подсчитайте общее количество живых клеток, как указано в шагах 1.1.2 и 1.1.3.
      2. Поместите RBMECs (60 000/^см2) на верхнюю поверхность вкладыша в sECM (1 000 μл) (Рисунок 1B), оставив 3 вкладыша только с астроцитами, для использования в качестве фона для трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER). Поместите многолуночный планшет в стандартные условия культивирования. Поддерживайте систему до состояния культуры не менее 3 дней, меняя sECM во внутренней и нижней камере каждые 2 дня.

2. Валидация BBB

1. Измерение TEER
   1. На^3-й день совместного культивирования проверьте TEER, вставив вкладыши с BBB в соответствующую камеру (с колпачком и где и камера, и колпачок содержат пару электродов, чувствительных к напряжению и току), заполненную 4 мл sECM. Подключитесь к вольт-омметру эпителиальной ткани.
   2. Вместе с измерениями TEER систем BBB ячеек запишите значения TEER для 3 вкладышей с RCA, которые будут вычтены из значений, полученных с помощью BBB. Умножьте полученные значения TEER на поверхность вкладыша (4,2^см2), чтобы выразить результаты как Ω x^см2.
   3. Начиная с^3-го дня со-культуры, измеряйте TEER каждый день. заметка: После начального периода, когда TEER увеличивается, зарегистрированные значения должны оставаться стабильными в течение как минимум двух дней подряд (обычно между^5-м и^7-м днями совместного проживания). На этом этапе ГЭБ готов ко второму этапу валидации (раздел 2.2) и/или ><к экспериментам с транс-ГЭБ. Примечание: Процедура, описанная в разделе 2.1, может быть выполнена на тех же BBB-системах, предназначенных для следующих экспериментов по проницаемости (раздел 3). Эксплуатация в стерильных условиях.

3. Транс-ГЭББ проникновение ферритинов, загруженных FITC (FnN)

Примечание: Рекомбинантный вариант человеческого ферритина (Fn), производимый в Escherichia coli и собранный в наноклетках (FnN). FnN загружены флуоресцеина изотиоцианатом (FITC), и концентрации как Fn, так и загруженных молекул точно определяются.

1. Транс-ГЭБ Поток FITC и FITC-FnN
   1. Измерьте поток FITC-FnN из верхней в нижнюю камеру валидированных моделей BBB (обычно на^5-7-й день совместного культивирования) по сравнению с потоком свободного красителя после 7 и 24 часов инкубации в соответствии со следующими этапами:
      1. Добавьте FITC-FnN (50 мкг/мл FnN, 1,1 мкМ FITC) или равное количество свободного FITC в верхнюю камеру, по меньшей мере, 6 систем BBB для каждой рецептуры, чтобы извлечь 2 мл раствора sECM из нижней камеры, состоящей не менее чем из 3 вставок, через 7 ч, и из нижней камеры из других 3 вставок через 24 ч.
      2. Измерьте интенсивность флуоресценции 500 мкл собранных образцов с помощью спектрофлуориметра (λ_ex 488 нм, λ_em 515 нм, щель 5).
      3. Получить фоновую флуоресценцию sECM можно путем измерения 500 мкл среды с использованием тех же аналитических параметров. Вычтите фоновую флуоресценцию sECM из всех значений флуоресценции FITC или FITC-FnN.
      4. Определить концентрацию проникнутого FITC или FITC-FnN путем сравнения полученных значений флуоресценции с двумя различными калибровочными кривыми, полученными с известными концентрациями (т.е. 6,87, 13,75, 27,5, 55 нМ) свободного или наноформулированного красителя, растворенного в 500 мкл сЭКМ.

Результаты

Рисунок 1: Затравка ячеек на вставки. Процедура посева RCA (A) и RBMEC (B) на две противоположные стороны многолуночных пластин.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга крысы	Иннопрот	П10308	выделенная из ткани мозга крысы Sprague Dawley, криоконсервированная в первом проходе и доставленная в замороженном виде
Корковые астроциты	Иннопрот	П10202	Выделена из 2 суток ткань мозга крысы, криоконсервирована при первом проходе и доставлена в замороженном виде.
Набор эндотелиальных клеточных сред	Иннопрот	П60104	ЭКМ (500 мл) и фетальная бычья сыворотка (25 мл), добавка для роста эндотелиальных клеток (5 мл) и пенициллин/стрептомицин (5 мл). Перед использованием подогреть на водяной бане 37 °C и беречь от света
Трипсин-ЭДТА без фенола красного	ЕвроКлон	ECM0920D	Перед использованием подогреть на водяной бане при температуре 37 °C
Флуоресцеин изотиоцианат-декстран 40000	сигма	ФД40С	беречь от света
Фосфатный буферный раствор Дульбекко без Ca и Mg	ЕвроКлон	ECB4004L
Тритон Х-100	сигма	Т8787
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А7906
Козья сыворотка	ЕвроКлон	ECS0200D
Поли-L-лизина гидробромид	сигма	П1274	Одно и то же решение можно использовать несколько раз
Фибронектин из плазмы крупного рогатого скота	сигма	Ф1141	Одно и то же решение можно использовать несколько раз
Вставки из полиэтилентерефталата (ПЭТ)	сокол	Ф3090	Прозрачные мембраны из полиэтилентерефталата (ПЭТ); площадь поверхности: 4,2 см2; размер пор 0,4 мкм/площадь поверхности
Колба T75 Primo TC	ЕвроКлон	ЭТ7076
Колба T175 Primo TC	ЕвроКлон	ЭТ7181
EVOM2 Вольт/Омметр эпителиальной ткани	World Precision Instruments Германия	ЭВОМ2
Чашка Endohm-24SNAP	World Precision Instruments Германия	ЭНДОМ-24СНЭП
Световой/флуоресцентный микроскоп с камерой	Leica Microsystems	Модуль камеры DM IL LED Fluo/ ICC50 W	Инвертированный микроскоп для живых клеток с камерой
Конфокальный микроскоп	Leica Microsystems	TCS SPE