Измерение активности протеасом в различных субклеточных компартментах мозга крысы

1. Анализ активности протеасом

ПРИМЕЧАНИЕ: Активность протеасом может быть измерена в гомогенизированной ткани мозга с помощью слегка модифицированной версии набора 20S Proteasome Activity Kit. Этот анализ не измеряет непосредственно активность полных комплексов 26S протеасом. Скорее, он измеряет активность ядра 20S, а это означает, что он может служить только прокси для понимания активности самого ядра, в отличие от всего комплекса протеасом 26S. Успех этого анализа снижается с повторными циклами замораживания-оттаивания и/или повышением уровня моющих средств, особенно ионных, и требует использования планшетного ридера с набором фильтров 360/460 (возбуждение/излучение) и возможностью нагрева до 37 °C.

1. Настройки считывателя пластин: Предварительно нагрейте до 37 °C и держите до конца работы.​
   1. Установите возбуждение на 360 и излучение на 460. Если используемая 96-луночная пластина свободна, установите положение оптики в положение Bottom. Если используется темный/черный 96-луночный планшет, установите положение оптики в положение Top.
   2. Установите для старых моделей считывателей пластин режим «Автоусиление» в разделе «Параметры флуоресцентного считывания»; более новые модели предварительно настроены для этого. Запрограммируйте кинетический прогон со временем 2 ч, сканирование (считывание) каждые 30 мин.
2. Восстановите в 10-кратном буфере для анализа, входящем в комплект, 13,5 мл сверхчистой воды. Добавьте 14 мкл 100 мМ АТФ в буфер теперь 1x; Это значительно повышает активность протеасом в образцах и повышает надежность анализа. Окончательный буфер для анализа 20S может храниться на льду или при температуре 4 °C до тех пор, пока он не понадобится, и будет стабильным в течение нескольких месяцев.
3. Восстановите стандарт AMC, поставляемый в комплекте, со 100 μл ДМСО. Выполняйте этот шаг в темноте или в условиях низкой освещенности, так как стандарт является светочувствительным.
4. Создание стандартной кривой AMC с использованием восстановленного стандарта в темноте или в условиях низкой освещенности.
   1. В отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 0,5 мл добавьте 16, 8, 6,4, 3,2, 1,6, 0,8, 0,4 и 0 мкл стандарта АМС, что соответствует концентрации 20, 10, 8, 4, 2, 1, 0,5 и 0 мкМ АМС.
   2. К этим пробиркам в том же порядке добавьте 84, 92, 93,6, 96,8, 98,4, 99,2, 99,6 и 100 мкл 20S пробного буфера. Это создает серию высоких и низких концентраций AMC, которые будут использоваться для калибровки считывателя планшетов и анализа активности протеасом в гомогенизированных образцах.
   3. Храните все разведенные нормы на льду в темноте до тех пор, пока они не понадобятся.
5. Восстановите протеасомный субстрат (Suc-LLVY-AMC), поставляемый в комплекте, с 65 мкл ДМСО. Выполняйте этот шаг в темноте или в условиях низкой освещенности, так как подложка чувствительна к свету. Создайте разведение субстрата протеасомы в соотношении 1:20 в новой микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл с использованием буфера для анализа 20S. Разведенный субстрат хранить на льду в темноте до тех пор, пока он не понадобится.
   заметка: Например, если в пластине будет 10 образцов и 1 заготовка, вам понадобится достаточно разбавленного субстрата для 22 лунок (с дубликатами) по 10 μл на лунку. Это соответствует потребности 220 мкл + 30 мкл для ошибок пипетирования, требуя 12,5 мкл субстрата и 237,5 мкл 20S буфера для анализа.
6. Разморозьте желаемые образцы (если они заморожены) и добавьте нормированное количество в 96-луночную пластину. Запускайте каждый образец в двух экземплярах. Количество необходимого образца варьируется в зависимости от подготовки ткани. Как правило, 10-20 мкг достаточно для любой субклеточной фракции.
7. Доведите объем лунки для образца до 80 мкл с помощью сверхчистой воды. Добавляемое количество зависит от объема добавленного образца. Например, если в образце 1 было 4,5 мкл белка, а в образце 2 — 8,7 мкл, то необходимое количество воды составит 75,5 мкл и 71,3 мкл соответственно. В две отдельные лунки добавьте только 80 μл воды; это будут пробирные бланки.
   заметка: Чтобы ограничить изменения объема белка из-за ошибок пипетирования, концентрацию белка можно нормализовать до наименее концентрированного образца. Это позволит использовать один и тот же объем образца во всех условиях.
8. Добавьте 10 мкл 20S буфера для анализа в каждую лунку, включая пробирные заготовки. В этом случае рекомендуется использовать репитер/автоматизированную пипетку, чтобы обеспечить равномерный объем анализа в разных лунках.
9. Дополнительно: На этом этапе при желании введите манипуляции in vitro; для этого потребуется, чтобы каждый образец имел дополнительные 2 лунки на одну процедуру, включая транспортное средство. Если это так, добавьте 5-10 мкл лекарственного средства/соединения, представляющего интерес, в 2 лунки для отбора проб и эквивалентный объем контрольного вещества/транспортного средства еще в 2 лунки. Поместите планшет на предварительно нагретый считыватель тарелок или в инкубатор с температурой 37 °C на 30 минут.
10. Выключите свет или войдите в темную комнату. Добавьте все 100 мкл разбавленных стандартов АМС в новую лунку; Каждый стандарт будет иметь одну скважину.
11. В темное время суток добавьте 10 мкл разбавленного протеасомного субстрата в лунки, содержащие образцы и заготовки для анализа, но не в соответствии со стандартом AMC. В этом случае рекомендуется использовать репитер/автоматизированную пипетку, чтобы обеспечить равномерный объем анализа в разных лунках.
12. Поместите пластину в считыватель пластин и начните кинетический пробег.
    заметка: Пластина не должна находиться под постоянным перемешиванием во время кинетического пробега, однако пользователь может выбрать это при желании
13. В конце кинетического прогона экспортируйте необработанные флуоресцентные значения 360/460 в Microsoft Excel.
    1. Усреднить вместе дубликаты лунок для каждого стандарта, каждого образца и пробного образца для всех 5 сканирований. Исходные значения флуоресценции должны увеличиваться при сканировании образцов, но оставаться стабильными (или немного снижаться) для стандартов и пробирных бланков.
    2. Возьмите самый высокий стандарт среднего значения AMC и разделите на известную концентрацию (20 мкМ). Разделите это значение на концентрацию образца, используемую в анализе, чтобы получить стандартизированное значение AMC. Для каждого образца и среднего значения пробного бланка разделите на стандартизированное значение AMC.
    3. Возьмите это окончательное значение и разделите его на концентрацию образца, используемого в анализе, чтобы получить нормализованное значение для каждого образца и бланка для анализа. Сделайте это для всех 5 сканирований.
    4. Вычтите нормализованное значение Assay Blank из каждого нормализованного значения образца для всех 5 сканирований.