Методическая статья

Получение клеточных суспензий из ишемизированных тканей мозга мышей

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Pösel, C., et al. Выделение и проточный цитометрический анализ иммунных клеток ишемизированного мозга мыши. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует процедуру выделения клеток мозга и инфильтрированных иммунных клеток из ишемизированных тканей мозга мышей путем ферментативного переваривания с последующим удалением клеточного мусора и миелина с помощью центрифугирования градиента плотности для изучения реакций на воспаление в исследованиях инсульта.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующей экспертизой по этике животных.

1. Приготовление реагентов

  1. Буфер для пищеварения (1 мл на полушарие): Растворите стандартизированную смесь очищенных пищеварительных ферментов, например, либеразы с низкой концентрацией термолизина (TL) до концентрации 2U/мл в сбалансированном солевом растворе Hanks Balanced Salt Solution (HBSS), содержащем кальций (Ca) и магний (Mg).
  2. Промывочный буфер с ДНКазой: Растворите ДНКазу I до концентрации 666 ЕД/мл в свободном HBSS (Ca/Mg (кальций/магний)), содержащем 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS).
  3. Промывочный буфер без ДНКазы: HBSS (Ca/Mg free), содержащий 10% FCS.
  4. Среда с градиентом плотности (5 мл на полусферу): приготовить исходную изотоническую среду с градиентом плотности (SIP; 100%) путем смешивания девяти частей среды градиента плотности с одной частью 1,5 М хлорида натрия. Разбавьте SIP до 25% плотности путем добавления соответствующего объема HBSS (без Ca/Mg), содержащего 3% FCS.

2. Диссоциация мозговой ткани на одиночные клеточные суспензии

  1. Аккуратно удалите ствол мозга и мозжечок чистым лезвием бритвы. Используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обеспечить кровоизлияние мозга и разрежьте каждое полушарие вдоль корональной плоскости на три части примерно одинакового размера.
  2. Измельчите рассеченную ткань каждого полушария через клеточное фильтр 100 мкм с помощью плунжера шприца объемом 5 мл. Непрерывно промывайте сетчатое фильтр ледяным HBSS (+Ca/Mg). Гомогенизированные образцы хранят на льду.
  3. Центрифугируйте при температуре 286 x g и 4°C в течение 5 минут, осторожно выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 1 мл буфера для разложения и переложите суспензию в пробирку объемом 2 мл. Инкубировать суспензию при медленном непрерывном вращении при температуре 37 °C в течение 1 часа.
  4. Просейте клеточную суспензию через клеточное ситечко 70 мкм и тщательно промойте 3 мл промывочного буфера, содержащего ДНКазу, а затем 15 мл промывочного буфера, не содержащего ДНКазы. Центрифугируйте при температуре 286 x g и 18 °C в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. заметка: Использование ДНКазы устраняет ДНК-слизь, вызванную лизисом клеток, что может привести к агрегации клеток, ставя под угрозу выживание клеток.

3. Центрифугирование с градиентом плотности для удаления миелина и клеточного мусора

  1. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 5 мл среды с градиентом плотности 25% и пипеткой поместите суспензию в пробирку объемом 15 мл. Тщательно перемешайте с помощью повторяющегося и осторожного пипетирования, не допуская образования пузырьков. заметка: Для предотвращения комкования клеток следует использовать среду с градиентом плотности.
  2. Центрифугируйте при 521 x g и 18 °C в течение 20 мин. Используйте самый низкий профиль ускорения ротора и дайте ротору остановиться без тормоза. Аккуратно извлеките пробирки из центрифуги, не встряхивая. Осторожно аспирируйте миелиновую оболочку и надосадочную жидкость, сохраняя клеточную гранулу на дне пробирки. заметка: Обязательно удалите всю миелиновую оболочку, так как любые остатки нарушят анализ проточной цитометрии.
  3. Повторно суспендируйте гранулу в 10 мл промывочного буфера без ДНКазы и поместите суспензию пипеткой в новую пробирку объемом 15 мл. заметка: Этот этап промывки имеет решающее значение, поскольку достаточное удаление градиентной среды значительно влияет на количество и качество конечного образца клетки.
  4. Снова центрифугируйте при 286 x g и 10 °C в течение 5 минут и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в 100 мкл холодного промывочного буфера и определите количество и жизнеспособность клеток путем исключения трипанового синего в гемоцитометре. Храните образцы при температуре 4 °C и в дальнейшем быстро обрабатывайте их.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вращатель трубок MACSmixМилтеньи Биотек ГмбХ
Heraeus Multifuge 3SR+Термо Сайентиал
Буферный раствор соли Хэнка (HBSS)Gibco/Life Technologies GmbH14175-129
HBSS с кальцием/магниемGibco/Life Technologies GmbHNo 24020-091
Liberase TLРош Диагностик ГмбХ5401020001Использование при комнатной температуре
Перколл ПлюсGE Healthcare Europe GmbHТел.: 17-5445-01
Фетальная бычья сывороткаПАН Биотех3302-P101003
Трипан синийGibco/Life Technologies GmbH15250-061
ТруконтBD Biosciences340334
Фосфатно-солевой буферБиохром АГЛ 182-10
ДНКаза IРош Диагностик ГмбХ11284932001
Силиконовая трубка, 1мМировые прецизионные приборы503022
Ножницы с тонкой радужной оболочкой острые/тупыеИнструменты для точной науки14028-10
Прямые щипцы с зубьями 1x2 зубаИнструменты для точной науки11021-14
Тупые щипцыИнструменты для точной науки11008-13
Поршень шприца 5 млCarl Roth GmbH (Braun)ЭП96.1
Сетчатый фильтр для ячеек, 100μмД-р И. Шуберт, BD2360-00
Omnican Fine дозировочный шприц 1 млБраунTBD
Сетчатый фильтр для ячеек, 70μмGreiner Bio-One GmbHТелефонный номер 542 070
Серологические пипетки, 10млGreiner Bio-One GmbH607180 (Английский
Серологические пипетки, 10млSarstedt AG&Co86,12,54,025
Серологические пипетки, 25млGreiner Bio-One GmbH760180
Серологические пипетки, 5млGreiner Bio-One GmbH606180
Серологические пипетки, 25 млSarstedt AG&Co86,16,85,020
Серологические пипетки, 5млSarstedt AG&Co86,12,53,025
Насадки, 0,1-10μлКорнинг B.V.Life наукиNo 4840
Наконечники, 100-1000μлGreiner Bio-One GmbH740290
Наконечники, 10-200μлGreiner Bio-One GmbH739296
Реакционные пробирки 1,5млGreiner Bio-One GmbH616201
Реакционные пробирки 2млGreiner Bio-One GmbH623201
Бактериологическая чашка Петри, 94x16ммGreiner Bio-One GmbHНомер 633180
Сокол 15млGreiner Bio-One GmbH188271
Сокол 50млVWR International GmbH (BD)734-0448 (Английский)
Гемоцитометр НойбауэраБиохром АГПДГК-Н01
лезвиеКарл Рот ГмбХСК07.1
гг. )

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи