Индукция дискинезий, индуцированных леводопой, на крысиной модели болезни Паркинсона

Аннотация

Источник: Caulfield, M. E., et al. Индукция и оценка дискинезий, вызванных леводопой, в модели болезни Паркинсона у крыс. J. Vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует процесс индуцирования дискинезии, вызванной леводопой, в модели крысы с болезнью Паркинсона путем введения леводопы вместе с ингибитором дофаминовой конверсии. Повторные инъекции чрезмерно стимулируют нейроны головного мозга, что приводит к двигательной дисфункции.

Протокол

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка реагентов и расходных материалов

1. Определите дозу L-3,4-дигидроксифенилаланина метилового эфира гидрохлорида (леводопа или L-ДОФА) и бенсеразида гидрохлорида, ингибитора периферической декарбоксилазы (см. Таблицу материалов), частоту оценки и сроки эксперимента, подходящие для исследуемого вопроса (рис. 1).
   заметка: Исследовательские вопросы могут быть поставлены для поиска любого количества ответов, начиная от вопроса о том, может ли конкретная терапия уменьшить существующие дискинезии (LID), индуцированные L-DOPA, до предотвращения индукции LID. Они также могут изучить, зависит ли терапевтическая эффективность от дозы леводопы или экспрессия LID и/или терапевтическая эффективность варьируется в зависимости от пола, вида и возраста субъекта.
2. Еженедельно взвешивайте крыс, чтобы рассчитать подходящее количество препарата на основе происходящих изменений веса во время исследования.
   заметка: Из-за повышенной активности у крыс LID+ существует потенциал для потери веса при длительном лечении L-ДОФА. Если происходит потеря веса, обеспечьте крыс полноценными, очень вкусными лакомствами (см. Таблицу материалов) после инъекций L-ДОФА.
3. Рассчитайте необходимое количество L-ДОФА и бенсеразида для каждой еженедельной концентрации, взвешивая лиофилизированные аликвоты для каждого дня инъекции и храните в комбинации в течение 1–2 недель при -20 °C в стеклянных янтарных флаконах до дня лечения.
   заметка: Целевая доза составляет 12 мг/кг или 12 мг L-DOPA/1000 г массы тела. В разделе «Дополнительная информация» приведен пример расчетов для определения количества L-ДОФА и физиологического раствора, необходимого для каждого дня недели, с использованием 12 мг L-ДОПА/кг массы тела при объеме инъекции 1 куб. см/кг массы крысы.

2. Установка комнаты и клетки

1. В первый день лечения L-ДОФА через 3-4 недели после операции по удалению 6-гидроксидопамина (6-OHDA) крыс переводят в одноместное жилье, включая обогащение, одобренное IACUC.
2. Оставайтесь в одном жилье на протяжении всего исследования, чтобы избежать вмешательства сверстников в поведенческие оценки.
3. В дни оценки LID поместите домашние клетки на решетку из стальной проволоки, повернутую под углом примерно 45° для оптимального обзора крысы (рис. 2A). Переверните идентификационные бирки (Рисунок 2B) вверх и уберите бутылки с водой, стеллажи для еды и все виды обогащения в клетке (Рисунок 2C), чтобы не мешать поведенческим оценкам.

3. Оценка инъекций леводопы и дискинезии

1. Подкожные инъекции L-DOPA
   1. Непосредственно перед ежедневным введением L-ДОФА добавьте соответствующий объем стерильного физиологического раствора в предварительно взвешенную лиофилизированную смесь L-ДОФА и бенсеразида в янтарный флакон и хорошо встряхните в течение 10 с (шаг 1.3).<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой объем инъекции составляет 1 мл/1000 г массы тела (с 12 мг L-DOPA на мл). Объем стерильного физиологического раствора будет зависеть от количества животных в одном исследовании.
   2. Наполните отдельные шприцы (например, 1,0 или 0,5 мл иглой 26 G) необходимым объемом для каждого животного (1 мл/кг веса крысы) и промаркируйте каждый шприц индивидуальной идентификацией животного.
      заметка: Храните наполненные шприцы в защищенном от света месте в стерильных мешочках до момента инъекции. L-ДОФА быстро окисляется в присутствии кислорода и света в водной среде.
   3. Поднесите первую клетку к столу для инъекций.
   4. Извлеките крысу из клетки и поместите ее на поверхность для инъекции.
   5. Аккуратно прижмите голову и плечи к поверхности, на которой упирается крыса, ладонью недоминирующей руки.
   6. Аккуратно взрыхлите кожу на тыльной стороне, расположенную над лопатками, большим и указательным пальцами недоминирующей руки. Затем введите объем L-DOPA доминирующей рукой в подкожное пространство между пальцами или под ними, держа иглу как можно ближе к телу, чтобы избежать внутримышечного введения.
      заметка: Крыс не обезболивают перед инъекцией.
   7. Утилизируйте каждый использованный отдельный шприц в острую емкость.
   8. Замените крысу в отдельную клетку и добавляйте питательные лакомства, за исключением дней оценки LID, чтобы избежать вмешательства в оценку поведения до тех пор, пока оценка не будет завершена.
   9. Установите таймер на 1–2 минуты в зависимости от желаемого времени оценки и количества крыс в исследовании в дни оценки. Принесите следующую клетку и введите следующую крысу, когда таймер покажет результат.
   10. Повторяйте это, вводя по одной крысе каждые 1–2 минуты, пока не будут введены все крысы.
2. Оценка дискинезии, вызванной леводопой, после инъекции
   1. Оцените интенсивность (Таблица 1) и частоту (Таблица 2) движений дистонической и гиперкинетической дискинезии в желаемое количество временных точек, которые должны включать в себя начальное начало поведения ЛИД, пиковое поведение и фазу снижения.
   2. Для самцов и самок взрослых крыс Sprague Dawley или Fisher 344 и размером выборки N = 40 крыс оценивайте дискинезию через 20 минут после первой инъекции L-ДОФА, а затем с интервалом в 50 минут до 220 или 270 минут после инъекции, в зависимости от того, когда поведение LID прекратилось у 90–100% крыс.
   3. Если вы используете интервал в 1 мин, установите таймер на 1 мин. Оцените первую крысу за одну минуту. Перейдите к следующей крысе и оценивайте ее в течение 1 минуты. Продолжайте перебирать всех крыс, оценивая с интервалом в 1 минуту.
   4. Таймер должен быть расположен рядом с клеткой на видном месте, чтобы можно было наблюдать интенсивность поведения LID (Таблица 1) при оценке частоты любого заданного поведения (Таблица 2) в течение периода оценки.
   5. После того, как оценки для первой временной точки завершены, начните снова с первой крысы в следующей временной точке (например, через 70 минут после инъекции) и продолжайте с желаемым интервалом (например, каждые 50 минут) до тех пор, пока не будут завершены все временные точки><. заметка: Из-за того, что задачи по введению L-DOPA и оценке LID перекрываются, в дни оценки требуется два человека: один для инъекций и один для поведенческих оценок.

Результаты

Рисунок 1: Пример графика лечения. Пример временной шкалы увеличения дозы L-DOPA общей продолжительностью 12 недель, при этом 8 недель инъекций L-DOPA начинаются через 3 недели после поражения 6-OHDA и через 4 недели после экспериментального лечения. В этом примере L-DOPA вводят подкожно 5 раз в неделю (с понедельника по пятницу) примерно в одно и то же время каждый день в течение 2 недель в каждой н...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Цифровой таймер на 100 минут	Скобы	1111764
Компактные весы Compass CX	Охаус	30428202
5-(2-аминоэтил)-1,2,4-бензолтриол, моногидробромид	Кайман Кемикалс	No 25330	6-OHDA представляет собой катехоламинергический нейротоксин, который используется для индукции дофаминергических поражений и симптомов паркинсонизма у грызунов.
Клетки Аллентауна	ООО «Аллентаун»	Рать900	Клетки Аллентауна обеспечивают возможность обзора крыс со всех сторон.
Лотки для аллергологов BD со стационарно прикрепленной иглой	БД	БД 305540	Для подкожных инъекций L-DOPA
Бенсеразида гидрохлорид	Сигма-Олдрич	В7283	Бенсеразид является периферическим ингибитором декарбоксилазы, используемым с L-DOPA для индуцирования дискинезии у моделей БП у грызунов.
Стеклянные янтарные сцинтилляционные флаконы	Термо Сайентиал	В7921	Используется для хранения L-ДОПА/бенсеразида при -20 °С до смешивания со стерильным физиологическим раствором.
L-3,4-дигидроксифенилаланина метиловый эфир гидрохлорид	Сигма-Олдрич	Д1507	Метиловый эфир L-3,4-дигидроксифенилаланина является предшественником L-ДОФА, который проникает через гематоэнцефалический барьер и используется для лечения симптомов паркинсонизма у грызунов.
Paper Mate Sharpwriter Механические карандаши	Скобы	107250 (Английский
Лакомства для грызунов, полноценно обогатляющие питательные вещества	Био-Серв	Ф05478
Круглое ведро для льда с крышкой, 2,5 л	Корнинг	432129
Стандартный пластиковый буфер обмена	Скобы	1227770
Стальные проволочные подвижные стеллажи длиной 6 футов	Улине	Н9488	Ширина/высота может быть отрегулирована в зависимости от потребности/количества крыс в эксперименте
Стерильный физиологический раствор 0,9%	Ковидиен/Аргайл	1020	Для смешивания с L-DOPA/bens

)