Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Характеристика старения нейронов в корковых органоидах
- Обработка кортикальных органоидов для криосекции:
заметка: Действия выполнялись в капюшоне класса биобезопасности 2.
- Приготовьте 2 мл пробирки, каждая из которых заполнена 1,5 мл 4% параформальдегида (PFA).
- Отрежьте конец наконечника пипетки P1000 (чтобы он был широким) и аккуратно перенесите каждый органоид в одну из подготовленных выше пробирок объемом 2 мл (по одному органоиду на пробирку).
заметка: Чтобы предотвратить смешивание избытка среды дифференцировки (DM) с PFA, дайте органоиду опуститься к отверстию наконечника для дозатора P1000 и положите наконечник прямо над верхней частью PFA в пробирке, прежде чем выводить органоид из него. Это позволит исследователю переносить только органоид и очень минимальные среды.
- Дайте процессу фиксации проходить при температуре 4°C в течение 1 часа.
- С помощью неразрезанного наконечника для пипетки P1000 осторожно отберите избыток PFA и добавьте 1,5 мл холодного 1x PBS (фосфатно-солевого буфера).
- Перенесите трубки в орбитальный шейкер со скоростью 70 об/мин на 10 минут при комнатной температуре (RT).
- Повторите процесс стирки с холодным 1x PBS три раза, чтобы убедиться, что все PFA были полностью удалены.
заметка: Не выбрасывайте PFA в обычные контейнеры для отходов; вместо этого подготовьте для этого специальный контейнер для утилизации химических отходов, так как PFA представляет опасность.
- Погрузите органоиды в 1x PBS, содержащий 30% сахарозы><, и инкубируйте при 4 °C, пока все органоиды не опустятся на дно пробирки.
заметка: Время, необходимое для погружения органоидов, зависит от их размера и возраста. Трехмесячные органоиды могут принимать до 5 часов.
- С помощью разрезанного наконечника для дозатора P1000 с широким отверстием аккуратно перенесите от трех до пяти органоидов в монтажную форму, содержащую монтажный раствор, состоящий из 30% сахарозы и 100% среды с оптимальной температурой резки (OCT) в соотношении 3:2.
- С помощью наконечника для дозатора объемом 10 мкл с помощью стереомикроскопа можно ориентировать и расположить органоиды в виде сетки.
- Поместите форму на сухой лед для затвердевания раствора сахарозы OCT, прежде чем приступать к криосекции (16-20 мкм) с помощью криостата.
заметка: Для бета-галактозидазы, связанной со старением, все ткани должны быть обработаны для разреза после того, как они опустятся. Для иммунофлюоресценции ткани могут быть обработаны для срезов на следующий день. Если срезы не окрашены сразу, их необходимо хранить при температуре -20 °C до последующей иммунофлюоресценции или бета-галактозидазы.
- Процесс анализа старения в корковых органоидах головного мозга:
заметка: Следующие шаги можно выполнить на обычном лабораторном столе.
- Перенесите предметные стекла в контейнер для окрашивания предметного стекла микроскопа с крышкой и промойте разрезанную органоидную ткань три раза 1x PBS в течение 10 минут при RT, чтобы удалить излишки монтажного раствора.
- После этого вымытую ткань инкубируют со свежеприготовленным раствором для окрашивания бета-галактозидазы в течение ночи при температуре 37 °C.
заметка: Окрашивающий раствор бета-галактозидазы изготавливают из фосфатного буфера (на 10 мл фосфатного буфера: 8,15 мл 1 М NaH2PO4, 1,85 мл 1 М Na2HPO4) скорректированного рН = 6, 100 мМ гексацианоферрата калия (III), 100 мМ тригидрата гексацианоферрата калия (II), 5 М NaCl, 1 М MgCl2, 20 мг/мл X-Gal. Избегайте использования стандартного инкубатора для клеточных культур, содержащего CO2, так как CO2 изменит pH окрашивающего раствора бета-галактозидазы.
- Чтобы удалить раствор бета-галактозидазы, промойте испачканные ткани 1x PBS три раза по 10 минут каждый в режиме RT.
- Смонтируйте промытые салфетки с помощью стеклянного антивыцветающего монтанта и дайте монтажному раствору застыть в течение 30 минут при RT перед просмотром под микроскопом.
