Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Вирусная инокуляция
- Стерилизация инъекционного шприца
- Снимите колпачок инсулинового шприца. Добавьте полиэтиленовую трубку в качестве кольца вокруг иглы, чтобы обеспечить достаточную глубину инъекции 2,5 мм. Погрузите шприц в этанол на 30 минут. Поместите шприц под ультрафиолетовое излучение на 30 минут
- Наденьте колпачок обратно на иглу. Заверните шприц в стерилизующий мешочек и заклейте его скотчем. Этикетка с датой приготовления.
- Инъекция вирусов
- Достаньте аликвоты сорта Daniel's TMEV из морозильной камеры при температуре −80 °C. Разморозьте вирус и держите его на льду. Избегайте размораживания и повторного замораживания вируса. Загрузите в шприц вирусную суспензию (3 x 105 единицу для образования бляшек [PFU], разведенную в 20 мкл фосфатно-солевого буфера [PBS] или модифицированной питательной среды Eagle medium [DMEM] от Dulbecco).
ВНИМАНИЕ: Вирус заразен для мышей, но не для людей.
- Очистите скамейку дезинфицирующим средством и работайте под поглотителем дыма. Прививка вируса не стерильна, а максимально чиста.
- Перенесите мышь в индукционную камеру анестезии и используйте 2% изофлуран в кислороде для индукции анестезии. Достижение хирургической толерантности занимает несколько минут; Корректируйте концентрацию в зависимости от дыхания животного и глубины анестезии.
- Перенесите мышь под наркозом под наркоз. Проверьте переносимость хирургического вмешательства, например, путем защемления пальцев ног. Вся процедура выполняется менее чем за 30 с, поэтому животному не нужно вдыхать изофлуран во время инъекции. Добавьте глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Очистите голову животного спиртовой салфеткой. Наклоните голову мыши немного влево так, чтобы место инъекции было направлено вверх.
- Оттяните кожу немного назад, введите иглу в голову и введите 20 мкл внутрикортикально на глубину 2,5 мм в височную область правого полушария (заднюю и медиальную к правому глазу).
- Выполняют инъекцию в одностороннем порядке в одно и то же полушарие у всех животных. Используйте глаз и ухо в качестве ориентиров для расположения теменной коры. Размещение было предварительно верифицировано гистологическим путем; см. Рисунок 1. Координаты инжекции по стереотаксической инжекции по отношению к брегме составляют −2,0 (AP); +3,0 (МЛ); −1,5 (DV).
- Оставьте шприц на месте на 5-15 с. Запишите, если есть утечки из инъекции или если видны пузырьки воздуха – в таком случае подготовьте новый шприц. Осторожно вытаскивая шприц, слегка поверните его. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- OPTIONAL: Закодируйте животное на хвосте или ухе в зависимости от местных процедур (необязательно, но легко, так как животное находится без сознания).
- Переложите животное в новую клетку, которая будет помещена наполовину на грелку (35-40 °C) во время восстановления после анестезии. Не оставляйте животных без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные могут быть снова размещены в группе после выздоровления (зараженные животные не смешиваются с фиктивно инфицированными животными). Инфицированные мыши не должны размещаться в одной комнате с неинфицированными мышами.
- Следите за весом мышей в течение первых 7 дней после заражения, так как они теряют вес после заражения и могут нуждаться в дополнительном кормлении.
2. Мониторинг судорог, вызванных обработкой
- Выполняйте эту процедуру экспериментатор, не видящий лечения. Поднесите все клетки к скамейке. Наблюдайте за животными на предмет судорог 2 раза в день во время световой фазы.
- Оцените судорожную активность по модифицированной шкале Расина: 0 = отсутствие изменений в поведении, 1 = движения рта и лица, 2 = кивок головой, 3 = односторонний клонус передних конечностей, 4 = двусторонний клонус передних конечностей с вставанием на дыбы, 5 = генерализованная тонико-клоническая активность с потерей постурального тонуса, иногда прыжки, 6 = длительные и чрезмерные прыжки и гиперактивность. Сообщайте о количестве и интенсивности приступов.
- Проведите загоном по клетке, чтобы издать шум.
- Переложите каждое животное в другой ящик и обратно.
- Осторожно встряхивайте клетку движениями вперед-назад, стараясь не трясти клетку так сильно, чтобы животные не ударились о бока или верхнюю часть клетки и не подверглись риску получения физической травмы.
- Следите за всеми животными в клетке на предмет судорог. В любое время, если у мыши случился припадок, перенесите его обратно в домашнюю клетку и запишите уровень припадка без дальнейшей стимуляции припадков шумом или обращением.
- Для животных, у которых судороги не схватились спонтанно или после легкого встряхивания клетки, спровоцируйте припадки более интенсивным обращением: осторожно переверните мышь, переворачивая ее за хвост слева направо.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные с судорогами гипервозбудимы и могут быть прыгучими.
- Еще раз понаблюдайте за каждым животным на предмет судорожного поведения. Повторите процесс для последующих клеток.
