Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовление раствора лизофосфатидилхолина (ЛПК)
- Растворите 25 мг порошка LPC (см. Таблицу материалов) с 250 μL смешанного раствора хлороформа и метанола (1:1) до получения 10% раствора LPC и переложите его в центрифужную пробирку объемом 500 μL.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если LPC не растворен полностью, поместите центрифужную трубку в ультразвуковой очиститель и ультразвукируйте на частоте 40 кГц в течение ~1 часа, чтобы получить однородный раствор.
- Разделите раствор на 3 μл/пробирку и храните при температуре −80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор можно хранить ~2 года.
- Перед операцией разбавьте раствор (шаг 1.2) 27 мкл 0,9% раствора хлорида натрия (NaCl) и подержите раствор на водяной бане постоянной температуры при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор непосредственно перед началом инъекции.
2. Подготовка к операции
- Используйте иглу 32 G (2 дюйма) для подключения к шприцу объемом 5 мкл (см. Таблицу материалов). Следите за тем, чтобы микролитровый шприц не был заблокирован. Наберите 5 μл раствора LPC для приготовления инъекции.
- Обезболивайте мышь в индукционной камере, подключенной к изофлурановому вапорайзеру с 3% изофлураном, смешанным со 100% кислородом со скоростью около 0,3 л/мин.
- Подтвердите глубину анестезии отсутствием рефлекса пальцев ног, пока дыхание ровное.
- Выбрейте голову мыши между ушами с помощью электробритвы. Наносите смазывающие глазные капли, чтобы предотвратить сухость роговицы во время процедуры.
- Затем поместите мышь в стереотаксическую рамку (см. Таблицу материалов) тыльной стороной вверх и закрепите голову носовым конусом и зубным зажимом. Поддерживайте анестезию с помощью 1,2%-1,6% изофлурана через нос.
заметка: Концентрацию изофлурана можно регулировать в зависимости от состояния дыхания мышей.
3. Хирургическая процедура
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные размещаются на грелке во время всех процедур.
- Закрепите мышь на стереотаксическом аппарате с помощью двусторонних ушных вкладышей. Убедитесь, что ушные планки находятся на одном уровне, а голова находится горизонтально и устойчиво.
- Продезинфицируйте кожу на голове, протерев ее несколько раз йодофором с последующим обливанием спиртом круговыми движениями. Затем с помощью скальпеля вырезают небольшой разрез около 1,5 см по средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп.
- Протрите череп ватным тампоном, смоченным в 1% перекиси водорода, пока не обнажатся брегма, лямбда и задний родничок. Поместите шприц на стереотаксический аппарат.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте перекись водорода с осторожностью и избегайте прикосновения к окружающим тканям.
- Обеспечьте горизонтальное положение головы животного (как спереди и сзади, так и слева и справа).
- Отрегулируйте ручку оси Z стереотаксической рамы так, чтобы кончик иглы и череп просто соприкасались, не изгибаясь, затем измерьте координату оси Z. Проверьте Z-координаты брегмы и заднего родничка.
- Отрегулируйте ушную планку так, чтобы разница между Z-координатами брегмы и заднего родничка составляла не более 0,02 мм. Затем следуйте тому же методу для измерения Z-координат соответствующих позиций слева и справа от средней линии. Отрегулируйте ушную планку так, чтобы левая и правая панели находились на одном уровне.
- Найдите мозолистое тело. Установите начало координат XYZ в bregma.
ПРИМЕЧАНИЕ: Первое место инъекции находится на расстоянии 1,0 мм латеральнее брегмы, на 2,4 мм в глубину и на 1,1 мм впереди. Второе место инъекции находится на 1,0 мм латеральнее брегмы, на 2,1 мм в глубину и на 0,6 мм впереди. Например, координата брегмы равна (0,0,0). Измерьте координату Z соответствующего местоположения, отмеченного как (-1, 1.1, X) и (-1, 0.6, Y). Можно определить, что координата первого места инъекции мозолистого тела равна (-1, 1.1, −[X + 2.4]), а второго места инъекции равна (-1, 0.6, −[Y + 2.1]).
- Как только место инъекции будет определено, сделайте отметку стерильным маркером на черепе и запишите координаты.
- Аккуратно просверлите отмеченное место сверлом для черепа (см. Таблицу материалов). Следите за тем, чтобы избежать кровотечения.
- Медленно переместите иглу в заданные координаты и начните инъекцию. Для индуцирования демиелинизации мозолистого тела вводят 2 мкл раствора ЛПХ (шаг 1.2) в каждое место инъекции (шаг 3.5.) со скоростью 0,4 мкл/мин.
- После инъекции удерживайте иглу в каждом месте еще 10 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы интервал двух инъекций составлял не более 20 минут.
- Наложите шов на кожу 4-0 и подождите, пока животное проснется в течение 10 мин. После операции вводите анальгетики в соответствии с правилами ухода за животными в учреждении.
Примечание: Рекомендуемое время для эвтаназии может быть определено в зависимости от цели эксперимента.