$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Приготовление растворов гемоглобина и ликвора
- Приготовьте стерильный раствор искусственной спинномозговой жидкости (aCSF), добавив 500 мкл раствора aCSF в микропробирку объемом 1,5 мл, и храните на льду.
- Приготовьте стерильный раствор гемоглобина в дозе 150 мг/мл, добавив 75 мг гемоглобина к 500 мкл аКСФ в микропробирке объемом 1,5 мл, и храните на льду.
2. Подготовка животного к инъекции
- Поверните грелку на средний уровень, чтобы поддерживать температуру тела крысы.
- Обезболите крыс на 4-й день после родов (P4) в индукционной камере, заполненной 3% изофлураном.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подтверждайте достаточную анестезию, используя реакцию на защемление пальца ноги/хвоста каждые 15 минут. Контролируйте анестезию с визуальным наблюдением за цветом тканей, температурой тела и частотой дыхания.
- Обезболивание с помощью подкожной инъекции карпрофена в дозе 5 мг/кг крысе, находящейся под наркозом.
- Лежащую под наркозом крысу поместить в стереотаксический аппарат с носом, расположенным в адаптере для анестезии с постоянным потоком 1,5% изофлурана.
- Затяните неразрывные ушные планки на наружном слуховом проходе, чтобы зафиксировать голову.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесите ветеринарную мазь, чтобы сохранить глаза увлажненными, если глаза открыты в возрасте инъекции.
- Очистите голову, чередуя с помощью стерильных аппликаторов с ватными наконечниками, смоченных в бетадине и 70% этаноле.
- Прикоснитесь пропитанным бетадином аппликатором к центру кожи головы и распределите бетадин по кругу, двигаясь к краям.
- Повторите шаг 2.6.1.1 с аппликатором, пропитанным этанолом.
- Повторите шаги 2.6.1.1 и 2.6.1.2 3 раза.
- Наложите стерильную хирургическую простыню для защиты операционного поля.
- С помощью стерильного скальпеля сделайте разрез 0,3 см вертикально вниз по центру головы, чтобы обнажить брегму черепа.
ПРИМЕЧАНИЕ: При введении из лямбды, обнажайте лямбду черепа, а не брегму.
- Используйте стерильный аппликатор с ватным наконечником, чтобы высушить область.
3. Настройка стереотаксического инжектора
- Наберите приготовленный на шаге 1.2 раствор гемоглобина в стерильный шприц объемом 0,3 мл иглой 30G и поместите шприц в систему стереотаксических инъекторов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При создании контрольных условий, наберите раствор aCSF, приготовленный на шаге 1.1, в стерильный шприц объемом 0,3 мл и продолжайте следовать протоколу.
- Включите интерфейс стереотаксического инжектора и нажмите кнопку Configuration , чтобы ввести настройки объема и скорости впрыска.
- Нажмите на Volume и установите объем на 20,000 nL (20 μL).
- Нажмите на Скорость инфузии и установите скорость на 8,000 нл/мин (8 μл/мин).
- Выйдите из Configuration , нажав на кнопку Reset Pos .
- Промойте кончик иглы, нажав на кнопку Infuse , пока на кончике иглы не появится небольшая капля раствора гемоглобина.
- Аккуратно выведите раствор гемоглобина с кончика иглы стерильным аппликатором с ватным наконечником.
4. Инъекция животного
- Установите bregma как ноль на стереотаксической инжекторной системе, регулируя медиолатеральное и переднезаднее положения шприца, прежде чем опустить кончик промытой иглы шприца, чтобы осторожно коснуться черепа в месте брегмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: При внедрении из лямбды установите lambda как ноль.
- Определите выбранные координаты.
- При инъекции из брегмы, у P4 крыс , описанных здесь, используйте на расстоянии 1,5 мм латерально, 0,4 мм спереди и 2,0 мм вглубь от брегмы.
- При инъекции из лямбды используйте следующие координаты для крыс P4: 1,1 мм латерально, 4,6 мм спереди и 3,3 мм вглубь от лямбды.
- Поднимите иглу шприца на 1 см над черепом, чтобы очистить кожу головы. Когда шприц поднят, приступайте к установке медиолатеральных и переднезадних координат.
- Опустите иглу шприца, чтобы аккуратно коснуться черепа. Убедитесь, что игла касается черепа.
- Установите дорсовентральную координату с периодом 30 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: При установке дорсовентральной координаты, игла проткнет череп. Необходимо следить за тем, чтобы шприц проходил через череп, не деформируя череп. Деформации черепа можно избежать путем медленного отвода иглы по дорсовентральной координате, если деформация происходит, а затем размещения иглы обратно по той же траектории. Это позволяет игле проходить через отверстие в черепе с меньшим усилием и без деформации.
- В интерфейсе стереотаксического инжектора нажмите кнопку Run , чтобы начать инъекцию.
- После завершения инъекции оставьте иглу шприца на месте на 2 минуты, чтобы свести к минимуму обратный поток раствора.
- Медленно извлекайте шприц по дорсовентральной координате в течение 2 минут, пока кончик иглы не окажется на 2 см выше кожи головы.
- Поверните рычаг стереотаксического инжектора в сторону от операционного поля.
5. Послеоперационный уход
- Закройте кожу головы монофиламентным швом 6-0. Сделайте один простой прерывистый шов в центре разреза 0,3 см.
- Извлеките щенка из анестезии и положите его на надежное место на грелке.
- Верните грызуна в домашнюю клетку для восстановления после наркоза под присмотром его матери.
ПРИМЕЧАНИЕ: Своевременное возвращение под опеку плотины снижает раннюю послеоперационную смертность.
- Наблюдение за животными на предмет обезболивания при потере выпрямляющего рефлекса каждый час после операции в течение 3 ч.
- Ежедневно наблюдайте за животными в течение 7 дней на предмет нормальной активности, приема пищи и набора веса. Следите за местом разреза на предмет заживления раны, закрытия и повторного появления шерсти на месте операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях, когда во время мониторинга наблюдаются неврологические изменения, такие как судороги, центральная депрессия или снижение аппетита, усыпьте животное с помощью внутрисосудистой перфузии или вывиха шейки матки под анестезией.
- Чтобы предотвратить инфицирование после закрытия шва и заживления раны, нанесите на место разреза местный тройной антибиотик.