Все процедуры, связанные с животными, были проверены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Подготовка к анализу на судорожные припадки
- Включите кнопку Power On на термокамере, а затем кнопку Heat On.
- Установите температуру термокамеры на уровне 50 °C с помощью клавиатуры на цифровом регуляторе температуры.
- Подождите минимум 1 час, чтобы нагреть камеру до 50 °C, прежде чем вводить первую мышь в камеру. Предварительный нагрев обеспечивает равномерный нагрев внутри камеры.
- Выстелите пол мышиной термокамеры подстилкой из початков.
- Установите видеозаписывающую камеру перед термокамерой, чтобы записывать каждое испытание анализа судорог, вызванных тепловым нагревом.
- Выстелите чашку Петри диаметром 140 мм толстыми слоями папиросной бумаги и положите ее на лед, чтобы она служила охлаждающей подушкой><.
заметка: В конце анализа отдельные мыши будут переведены на предварительно охлажденную охлаждающую подушку, чтобы помочь снизить повышенную температуру их тела.
2. Подготовка мыши к анализу на судороги, вызванные теплом
- Выберите 10 взрослых мышей (P30-P40), 5 из которых являются носителями мутации, вызывающей эпилепсию, и 5 однопометников дикого типа для скринингового анализа на судороги, вызванные жарой.
заметка: Мыши дикого типа, не несущие мутаций, вызывающих эпилепсию, не проявляют тепловых припадков при температуре ниже 44 °C и являются контрольной группой.
- Взвесьте каждую мышь, которая будет использоваться для скринингового анализа, и запишите ее вес. Для проведения анализа следует использовать только мышей весом 15 г и более.
- Экранируйте по одной мыши за раз в мышиной термокамере.
- Кратковременно обезболите мышь в течение 10-15 с, используя несколько капель изофлурана на дне баночки-колокольчика.
- Достаньте животное из банки с колокольчиком и положите его на бумажное полотенце.
- Убедитесь, что мышь полностью обезболивается, убедившись, что мышь не реагирует на вредное защемление пальца ноги.
- Смажьте металлический наконечник ректального температурного зонда лубрикатом (например, вазелином) и аккуратно введите его в мышь на глубину меньше или равную 2 см.
- Закрепите ректальный зонд на хвосте мыши с помощью скотча, чтобы зонд не вышел во время анализа.
заметка: В качестве альтернативы поместите животное в конус удерживающего устройства для мыши и вставьте ректальный датчик температуры. Закрепите его, прикрепив скотчем к хвосту.
- Убедитесь, что ректальный зонд подключен к мультиметру, который отображает внутреннюю температуру тела мыши.
- Поместите животное в свежую клетку, выстланную подстилкой из початков, т.е. клетку для восстановления.
- Запустите таймер и подождите 5 мин. Наблюдайте за мышью до тех пор, пока она полностью не оправится от анестезии и не станет активной и ухаживающей за собой.
- Одновременно контролируйте температуру тела мыши до тех пор, пока она не стабилизируется на уровне 35-36 °C.
- По истечении 5 минут обратите внимание на температуру тела мыши. Это начальная температура тела в момент времени "0" мин.<бр/>
заметка: Если температура тела мыши ниже 35 °C, подождите дополнительное время, пока животное не оправится от гипотермии, вызванной анестезией.
- Быстро перенесите отдельную мышь в предварительно нагретую мышиную камеру. Это знаменует собой НАЧАЛО экспериментального испытания. В каждый момент времени проверяется только одна мышь.
3. Анализ на судороги, вызванные теплом
- Аккуратно положив мышь на пол предварительно нагретой мышиной термокамеры, закройте дверцу из плексигласа и запустите камеру для видеозаписи эксперимента.
- Запустите секундомер. Записывайте температуру тела мыши с помощью ректального термометра с интервалом в 1 минуту в течение всего эксперимента.
- Через равные промежутки времени повышайте температуру нагревательной камеры мыши таким образом, чтобы температура тела мыши увеличивалась со скоростью 0,25-0,5 °С/мин.<бр/>
заметка: Быстрое повышение температуры тела может привести к тепловому удару или смерти, и его следует избегать.
- Следуя этому протоколу, увеличивайте температуру тепловой камеры мыши на 5 °C каждые 10 минут, как показано на рисунке 1A.
- Через 9,5 мин установите температуру термокамеры на 55 °C, чтобы стабилизировать температуру термокамеры на уровне 55 °C к 10-й минуте, как показано на цифровом дисплее температуры.
- Аналогичным образом увеличьте температуру до 60 °C через 19,5 мин, чтобы стабилизировать температуру термокамеры до 60 °C к 20-й минуте. Каждое испытание скрининга судорог длится 30 минут.
- Если у мыши случился припадок (она издает звуки, кивает головой, клонус передних конечностей, разгибает заднюю конечность, падает на бок или испытывает генерализованные тонические/клонические конвульсии), запишите следующую информацию.
- Запишите температуру тела мыши во время припадка (пороговую температуру припадка) с помощью ректального термометра.
- Запишите характеристики судорожного поведения, такие как кивок головой, клонус передних конечностей, разгибание задних конечностей, падение на бок и/или генерализованные тоникические/клонические судороги (GTCS), демонстрируемые мышью.
- Быстро, но аккуратно возьмите мышь из камеры и положите ее на охлаждающую подставку, подготовленную на шаге 1.6.
заметка: Если мышь испытывает судороги по шкале Расина 5 и проявляет неконтролируемые прыжки, может быть трудно поднять животное из термокамеры и перенести его на охлаждающую подставку снаружи. Тем не менее, типичный тепловой припадок длится от 30 до 60 с. Таким образом, мышь следует вынуть из термокамеры и положить на охлаждающую подушку в течение 60 с после начала приступа теплового припадка.
- Подождите, пока температура тела мыши снизится до 36-37 °C, прежде чем переводить ее в клетку для восстановления. За один раз в клетку для восстановления помещается только одна мышь.
заметка: Не смешивайте мышей, которые еще не использовались для скрининга, вызванного теплом, с мышами, которые уже испытали эксперимент по индуцированному тепловым припадку.
- Аккуратно и осторожно отрежьте ножницами ленту между хвостом мыши и проволокой ректального зонда, чтобы извлечь ректальный зонд из мыши.
- Протрите металлический наконечник ректального зонда 70% спиртом и салфетками для мягких тканей, чтобы он был готов к следующему испытанию.
- Продолжайте наблюдать за мышью в клетке для восстановления, пока она не вернется к нормальной активности (ходьбе, уходу за шерстью и т. д.), прежде чем вернуть мышь в ее домашнюю клетку. Это знаменует собой КОНЕЦ эксперимента для этой мыши.
- Запишите состояние животного после проведения анализа – живое и восстановленное после пробного сеанса или мертвое. Высокоинтенсивные припадки, включающие неконтролируемые прыжки и генерализованные тонико-клонические припадки, иногда могут привести к смерти мыши.
- Если в течение 30 минут наблюдения у мыши не наблюдаются тепловые судороги или температура тела мыши достигает 44 °C, извлеките мышь из термокамеры и положите на охлаждающую подставку до тех пор, пока температура тела мыши не вернется к 36-37 °C.
- Сбросьте температуру термокамеры мыши до 50 °C и дайте ей уравновеситься до тех пор, пока температура дисплея на цифровом регуляторе температуры не покажет 50 °C.
- Меняйте подстилку в початках между отдельными испытаниями у мышей.
