Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Окрашивание первичного антитела и биоцитина
(День 1)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура иммуноокрашивания предназначена для свободно плавающих секций и требует непрерывного встряхивания с низкой скоростью (2 оборота/мин, об/мин) на шейкере на всех этапах инкубации.
- Промойте салфетку 3 раза по 10 мин каждый при 0,1 М PBS (pH = 7,4).
ПРИМЕЧАНИЕ: 0,1 M PBS может быть коммерчески приобретен или изготовлен в лаборатории следующим образом (составляет 1 л): 8 г NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na2HPO4, и 0,24 г KH2PO4 в 1 л dH2O.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если известен желаемый нейрохимический маркер, окрашивание на белок/пептид может быть выполнено одновременно с окрашиванием биоцитина (шаги 1.2 - 1.4). Если окрашивание производится только на биоцитин, перейдите к шаг 1.5.
- НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Заблокируйте 10% блокирующей сывороткой (BS; нормальная козья сыворотка (NGS), разведенная в 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 1 часа в RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина должна получать одинаковый объем раствора; рекомендуемый объем составляет от 250 до 500 мкл/лунка. Выбор блокирующей сыворотки основан на видах, у которых повышены вторичные антитела (, например, NGS используется для конъюгированных с краителем козьих анти-(соответствующие виды первичных антител)). Если возникает необходимость использования вторичных антител, выращенных у разных видов, в срезы иммуноокрашивания, включите 10% каждой нормальной сыворотки на стадии блокирования (2) и 3% каждой нормальной сыворотки на стадии первичной и вторичной инкубации антител.
- (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Инкубируйте срезы первичного антитела, CB1R (поликлональный, морская свинка), с 0,3% Triton X-100 и 3% BS в 0,1 M PBS при RT O/N. CB1R используют для определения экспрессии каннабиноидных рецепторов типа 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным и не является обязательным для выявления биоцитинового наполнения. На рисунке 2 показан участок, помеченный для биоцитина и CB1R во время первого процесса окрашивания. Инкубация O/N при ЛТ достаточна для большинства первичных антител; однако некоторые первичные антитела, включая CB1R, требуют 3-5 дней инкубации. Если инкубация должна длиться дольше 1 дня, рекомендуется проводить инкубацию при температуре 4 °C, поскольку Triton X-100 может проникать в срезы и может привести к распаду ткани при длительной инкубации при комнатной температуре. Включайте отрицательный контроль, в котором отсутствует первичное антитело, по меньшей мере в один раздел для каждой серии экспериментов в качестве контроля специфичности вторичного антитела. При отрицательном контроле первичное антитело опускают, но добавляют 0,3% Triton X-100 в 0,1 М PBS и BS.
(День 2)
- Промыть участки мозга 3 раза по 10 мин каждый в 0,1 М PBS (pH = 7,4).
- Инкубируйте срезы в конъюгате стрептавидина с красным красителем (концентрация: 1:1000; возбуждение: 594 нм с излучением в видимом красном спектре) с 0,3% Triton X-100 и 3% BS в 0,1 М PBS при 4 °C O/N в темноте (завернутым в алюминиевую фольгу) для выявления биоцитина. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: Включите вторичное антитело, козью противоморскую свинку (концентрация: 1:500; возбуждение: 488 нм и излучение зеленого цвета), с вышеупомянутой инкубацией после необязательной первичной инкубации на шаге 1.3.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное антитело потребуется только в том случае, если выполняется необязательное окрашивание первичными антителами (шаг 1.3). Для визуализации биоцитина рекомендуется использовать стрептавидин-флуорофорный конъюгат со спектром излучения, выделенным красным цветом, так как он помогает визуализировать более тонкие аксоны в деталях и с лучшим контрастом (Рисунки 1 - 3).
(День 3)
- Промойте срезы мозга 3 раза по 10 мин каждый в 0,1 М PBS (pH = 7,4).
- Для защиты флуоресценции и облегчения повторного окрашивания в будущем установите секции в монтажный материал на водной основе и заклейте края покровного стекла прозрачным лаком для ногтей.
ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше всего восстанавливать участки как можно раньше, чтобы избежать трудностей со снятием лака с предметного стекла, заражения плесенью и обезвоживания тканей из-за утечки монтажной среды из предметного стекла. Микробное загрязнение можно предотвратить, используя 0,02% азид натрия в PBS.
ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен и легко воспламеняется при контакте с водой. Пожалуйста, ознакомьтесь со стандартными операционными процедурами по обращению с опасными химическими веществами и их утилизации.
(Дни 4 - 7)
- Выполните конфокальную визуализацию с возбуждением на длине волны 594 и 488 нм и при увеличении 20X или 40X, чтобы выявить заполненные биоцитином нейроны красным цветом и нейрохимические маркеры (CB1R) зеленым цветом. Оценка совместной маркировки (Рисунок 2).
- Установите выдержку камеры менее чем на 100 мс, чтобы избежать фотообесцвечивания и получить конфокальные стеки изображений аксональных и дендритных лучей всего нейрона. Используйте стеки конфокальных изображений и пакеты программного обеспечения для отслеживания нейронов для реконструкции морфологии нейронов.
