1. Подготовка ректальной аспирационной биопсии (RSB) разделы
- Поместите ректальную аспирационную биопсию в 4% параформальдегид на 6 часов для фиксации ткани. Используйте фиксирующий объем в 5 раз больше объема ткани.
- Обезвоживайте ткани с помощью патологического дегидратора в течение 11 ч. Весь запрограммированный процесс состоит из следующих 5 шагов:
- Поместите салфетку в формальдегид и зафиксируйте на 1 ч.
- Поместите салфетку в 75% этанол на 4 часа.
- Поместите салфетку в абсолютный этанол (две смены, по 1 часу каждая).
- Поместите салфетку в абсолютный этанол (две смены по 30 минут каждая).
- Поместите салфетку в ксилол (три смены по 1 часу каждая).
- Поместите салфетку в парафин (58-60 °C) (три смены по 1 часу каждая). Заложите ткани РСБ в парафиновые блоки.
- Обрежьте парафиновые блоки с помощью микротома до тех пор, пока ткань полностью не обнажится с плоскостью полного сечения.
- Разрежьте блоки на участки размером 0,4 мкм с помощью микротома.
- Поместите секции в воду с температурой 45-50 °C на несколько секунд каждая, чтобы они могли разлиться в плоскую тарелку.
- Переложите парафиновые срезы на горки.
- Выпекать горки в духовке при температуре 60 °C в течение 3-5 часов. Избегайте слишком долгого выпекания, это может привести к потере антигенов.
- Поместите депарафинизированные предметные стекла в ксилол (2 смены по 15 минут каждая).
- Увлажните предметные стекла в абсолютном этаноле, 95%, 80% и 75% этаноле в течение 5 минут каждая. Затем промойте их в воде, очищенной методом обратного осмоса (RO), еще 5 минут.
2. Извлечение антигена
- Сделайте рабочие разведения для получения кальретинина, смешав 4 мл буфера для восстановления антигена этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) с 200 мл воды, очищенной методом обратного осмоса. Проводите рабочие разведения для извлечения S100 и Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5), смешивая 1 мл буфера цитрата натрия лимонной кислоты (100x) с 99 мл воды, очищенной методом обратного осмоса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Кальретинин может быть получен преимущественно с помощью раствора для извлечения ЭДТА. Тем не менее, буфер цитрата натрия лимонной кислоты более подходит для извлечения S100 и PGP9,5.
- Поместите слайды в банку для окрашивания коплином. Наполните банку поисковым раствором и поставьте ее на разогретую кипящую водяную баню. После кипячения в течение 20 минут снимите банку с водяной бани и дайте ей остыть до комнатной температуры. Процесс охлаждения занимает примерно 10 минут. Снимите предметные стекла и аккуратно промойте их один раз фосфатно-солевым буфером (PBS).
- Нарисуйте круг маркером вокруг ткани и подготовьте влажную коробку для следующих процедур.
3. Блокировка
- Сделайте рабочие разведения, смешав 3 мл 30% H2O2 с 27 мл воды, очищенной RO.
- Капните две или три капли 3% раствора H2O2 по каплям на ткань, чтобы блокировать пероксидазы. Немедленно добавьте решение H2O2, чтобы убедиться, что оно не выходит за пределы круга. Заблокируйте пероксидазы в инкубаторе при температуре 37 °C на 20 мин.
- Аккуратно промойте слайды PBS (три стирки по 5 минут каждая).
- Заблокируйте предметные стекла на 20 минут при температуре 37 °C 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA, приготовленным путем смешивания 1,5 г порошка BSA с 30 мл воды, очищенной RO).
ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирование 3% перекисью водорода может предотвратить 95% неспецифического окрашивания, а блокирование 5% BSA может предотвратить остальные 5% неспецифического окрашивания. Комбинируйте два метода для получения надежного результата.
4. Реакция антиген-антитело
- Удалите 5% БСА и добавьте 50 мкл первичного антитела (кальретинина, S100 или PGP9.5) на предметное стекло. Инкубировать в течение ночи при 4 °C.
- Промойте предметное стекло PBS (три раза, по 3 мин каждый).
- Добавьте 50 мкл полимерного усилителя (реагент А; см. Таблица материалов) в срез и инкубируйте его в течение 20 мин в инкубаторе при температуре 37 °C. Затем промойте предметное стекло PBS (три раза, по 3 мин каждый).
- Добавьте 50 мкл вторичного антитела B (вторичное антитело IgG козы против кролика/мыши) в срез и инкубируйте в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37 °C. Промойте секцию PBS (три раза, по 5 мин каждый).
5. 3,3-диаминобензидин и окрашивание гематоксилином
- Добавьте 850 мкл воды, очищенной RO, в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте окрашивающие реагенты (см. Таблица материалов) в порядке А, В и С. Добавьте по 50 мкл каждого реагента, чтобы получить в общей сложности 1 мл рабочего раствора 3,3-диаминобензидина (DAB). Если есть осадки, используйте раствор после фильтрации.
- Добавьте каплю рабочего раствора DAB на участок ткани и окрашивайте на 3-10 минут. Инкубируйте предметные стекла в DAB при комнатной температуре до тех пор, пока не будет обнаружено коричневое окрашивание. Внимательно следите за происходящим с помощью светлопольного микроскопа. Храните рабочее решение DAB вдали от света. Затем промойте предметное стекло PBS в течение 5 минут.
- Добавьте каплю гематоксилина для противостояния ядрам примерно на 1 минуту. Затем держите банку с коплином и промойте ее под струей воды примерно 30-40 с, пока излишки красителя не будут удалены. Будьте осторожны, чтобы не повредить участки тканей.
- Погрузите предметные стекла RSB в банку с коплином, содержащую PBS, на 25-30 с. Затем дифференцировать в 1% соляную кислоту-этанол в течение 10 с. Промойте предметные стекла PBS в течение 1 мин.
- Обезвоживайте предметные стекла в порядке, обратном увлажнению: 75%, 80%, 95% и абсолютный этанол (по 5 мин).
- Подвергайте предметные стекла воздействию ксилола (2 смены по 5 минут каждая).
- Установите покровное стекло с помощью ультрачистого монтажа. Дайте предметным стеклам высохнуть перед визуализацией с помощью микроскопа.