Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Приготовление диссекционных растворов и искусственной спинномозговой жидкости
- Карбогенат сверхчистой воды (то есть вода, отфильтрованная с удельным сопротивлением 18,2 МОм·см) с карбогеном (95% O2/5% CO2) в течение 5 минут с помощью диффузоров воздушных камней (аэраторов для аквариумов).
Примечание: Воздушные камни могут быть подключены к регулятору бака для карбогена через стандартную силиконовую трубку . Если воздушные камни недоступны, закройте конец силиконовой трубки и проделайте небольшие отверстия в уплотнении, чтобы карбогенный газ мог пузыриться и карбогенизировать раствор.
- Приготовьте раствор для препарирования, растворив растворенные вещества из Таблица 1 в сверхчистой воде. Добавьте CaCl2 в раствор, который был карбогенирован не менее 5 минут, чтобы помочь ему раствориться.
Примечание: В качестве альтернативы, сначала добавьте CaCl2, чтобы он мог легко раствориться в ненасыщенном растворе. Раствор в жидкой форме должен составлять 300 - 320 мОсм/л и иметь pH 7,4 после насыщения карбогеном.
- Охладите раствор для рассечения до 0 - 4 °C. Оставьте раствор в холодильнике на ночь или поместите раствор в морозильную камеру на 1 час и постоянно контролируйте температуру.
Примечание: Раствор для вскрытия можно хранить до 3 ночей; После этого выбросьте.
- Карбогенировать раствор для рассечения в течение 5 - 10 минут перед использованием.
Примечание: В идеале, раствор должен либо выглядеть как слякоть, либо переходить в слякоть перед использованием.
- Приготовьте для грызунов искусственную спинномозговую жидкость (ACSF), растворив растворенные вещества из Таблица 2 в ультрачистой воде. Карбогенируйте раствор ACSF, пока он находится на водяной бане, нагретой до 35 °C, до использования. Добавьте CaCl2 в раствор, который был карбогенирован не менее 5 минут, чтобы помочь ему раствориться.
Примечание: В качестве альтернативы, сначала добавьте CaCl2, чтобы он мог легче раствориться в ненасыщенном растворе. Раствор в жидкой форме должен иметь концентрацию 290 - 320 мОсм/л и pH 7,4 после насыщения карбогеном. Растворы следует вносить в объеме 1, 2 или 4 л в зависимости от длительности экспериментов. Приготовьте 4 л на целый день (8 часов) экспериментов. ACSF следует обновлять каждый день; Не храните его дольше 1 дня.
2. Вскрытие мышей для сбора мозговой ткани
- Соберите все инструменты и материалы, необходимые для вскрытия животных. Обустройте рабочее пространство для подготовки к вскрытию животных.
- Проверьте бак карбогена (95%O2/5%CO2), чтобы убедиться, что он не пуст. Замените газовый баллон перед экспериментом, если оставшееся давление составляет менее 500 фунтов на квадратный дюйм.
- Откалибруйте вибратом (слайсер для салфеток с вибрирующим лезвием) в соответствии с инструкцией по эксплуатации производителя. Отрегулируйте настройку вибратома так, чтобы амплитуда резки составляла 1 мм, а скорость резки — 0,12 мм/с.
Примечание: Оптимальные настройки могут отличаться для каждого отдельного резака с вибрационным лезвием; Однако, в целом, амплитуда должна быть высокой, а скорость резки низкой.
- Заполните инкубационную камеру для среза мозга (т.е., хранитель среза мозга) ACSF и наполните ее карбогеном. Затем поместите инкубационную камеру на водяную баню, установленную при температуре 35 °C.
- Приобретите молодую мышь любого пола в возрасте от 13 дней (p13) до 21 дня (p21, где p0 — дата рождения).
- Обезболивайте мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции пентобарбитала натрия (55 мг/кг массы тела). После того, как мышь будет глубоко обезболиваена, о чем свидетельствует отсутствие рефлекса защемления пальцев ног, немедленно используйте одобренный ветеринаром гильотинный инструмент, чтобы обезглавить мышь одним быстрым движением.
Примечание: Приготовьте инъекцию пентобарбитала натрия в соответствии с процедурами, рекомендованными институциональными рекомендациями.
- Возьмитесь за нос мыши, чтобы стабилизировать обезглавленную голову, и аккуратно сделайте разрез по средней линии, начинающийся между глазами мыши и по всей длине кожи головы, чтобы обнажить череп. Убедитесь, что череп не сдавлен давлением бритвы. Используйте угол лезвия бритвы для повышения точности среза.
- Раздвиньте лоскуты кожи головы мыши, обнажая череп пальцами. Затем используйте свежий угол лезвия бритвы, чтобы сделать надрез по средней линии черепа; Будьте внимательны, избегайте любого контакта с корой головного мозга.
- Вставьте щипцы от осколков в глазницы мыши, чтобы стабилизировать обезглавленную голову, и поместите ее в чашку Петри, наполненную холодным (0 - 4 °C) раствором для препарирования. Убедитесь, что голова полностью погружена в раствор для препарирования.
- С помощью второго набора щипцов от осколков аккуратно снимите кожу головы мыши, удалите носовую кость путем ее отслаивания и удалите заднюю (каудальную сторону) черепа.
Примечание: Носовая кость молодых мышей очень мягкая и легко ломается.
- С помощью микрошпателя перережьте зрительные нервы, тройничные нервы и спинной мозг. Затем с помощью микрошпателя аккуратно отделите мозг от черепа. Оставьте мозг полностью погруженным в чашку Петри, наполненную раствором для вскрытия.
3. Приготовление корковых срезов из соматосенсорно-моторной коры
- Заполните буферный лоток вибратома ~150 мл холодного (0 - 4°C) раствора для рассечения.
Примечание: По желанию, оставьте буферный лоток в морозильной камере до тех пор, пока это не потребуется для поддержания низкой температуры во время процедуры нарезки.
- Приклейте мозговую ткань мыши к вибратомному столику (держателю образца/лотку) с помощью мгновенного клея. У мышей отрежьте небольшую каудальную часть мозга (, т.е. , мозжечок), чтобы ее можно было легко приклеить к держателю образца (позволяя ростральной стороне мозга быть обращенной к потолку).
Примечание: В качестве альтернативы, горизонтальные срезы мозга мыши могут быть приготовлены путем приклеивания дорсальной стороны мозга к держателю образца (вентральная сторона мозга должна быть обращена к потолку).
- Аккуратно поместите держатель для образцов (с тканями мозга) в буферный лоток. Убедитесь, что дорсальная часть мозга обращена к лезвию вибратома.
Примечание: Очень важно свести к минимуму время, в течение которого мозг подвергается воздействию воздуха.
4. Секция и сбор тканей мозга
- Разрежьте мозг на срезы толщиной 450 мкм с помощью вибратома в дорсальном и вентральном направлении. Убедитесь, что мозг остается полностью закрепленным на лотке для образцов во время его нарезки.
- Сделайте первый надрез в мозгу мыши, чтобы удалить обонятельную луковицу. Затем делайте последующие надрезы до тех пор, пока не будет наблюдаться соматосенсорно-моторная область (расположенная примерно на полпути между обонятельной луковицей и брегмой).
Примечание: По желанию, разрежьте мозг на более тонкие (200 мкм) срезы до тех пор, пока мозолистое тело не появится в корональной проекции мозга, что указывает на то, что соматосенсорно-моторная область находится близко.
- С помощью широкопроходной переводной пипетки соберите корональные срезы (450 мкм), содержащие соматосенсорно-моторную область, и погрузите их в чашку Петри, содержащую холодный (0 - 4 °C) раствор для рассечения.
- Используйте новое лезвие бритвы и срежьте лишнюю ткань с срезов. Для корональных срезов у мышей выполните поперечный разрез чуть ниже неокортикальной комиссуры (т.е., мозолистое тело). Не режьте пилящими движениями; Просто надавите лезвием на ткань и аккуратно отделите ткань щеткой для детейлинга. Убедитесь, что движение коронального среза сведено к минимуму.
- Используйте широкозахватную передаточную пипетку для переноса дорсальной части корональных срезов, содержащих неокортекс (слой 1–6), во вторую чашку Петри, заполненную теплой (35 °C) ACSF на мгновение (~1 с). Затем быстро перенесите ломтики в инкубационную камеру, содержащую теплый (35 °C) карбогенированный ACSF.
Примечание: Цель переноса в чашку Петри с помощью ACSF - свести к минимуму перенос диссекционного раствора в инкубационную камеру при переносе срезов мозга с помощью широкозахватной пипетки. Используйте несколько лунок инкубационной камеры, чтобы поддерживать порядок в различных срезах мозга.
- Выбросьте остальную часть мозга и тушу животного в соответствии с рекомендациями учреждения.
5. Инкубация и обслуживание
- Оставьте срезы мозга слегка погруженными в инкубационную камеру при температуре 35 °C на 30 минут. Затем снимите инкубационную камеру с водяной бани и дайте ей вернуться к комнатной температуре (20 - 25 °C). Подождите 1 час, пока срезы мозга восстановятся, прежде чем выполнять электрофизиологическую запись.
Примечание: Убедитесь, что под срезами мозга в инкубационной камере не собираются пузырьки воздуха. Пузырьки воздуха — это воздушные интерфейсы, которые вызывают повреждение тканей. Срезы мозга мыши можно выдерживать в течение 6 - 8 ч в хорошо оборудованной инкубационной камере с ACSF.
6. Электрофизиологические записи поверхностного коркового слоя
Примечание: Иктальные события наблюдаются в записях внеклеточного локального потенциала поля (LFP) из срезов мозга. LFP среза мозга можно наблюдать и регистрировать либо с помощью камеры интерфейсного типа, либо с помощью системы с несколькими электродами (MEA).
- С помощью переводной пипетки с широким отверстием или щетки для детейлинга переместите срез мозга на предварительно вырезанную бумагу для линз немного большего размера, которую удерживают на месте с помощью стоматологического пинцета. Перенесите бумагу для линз (на которую опирается срез мозга) в записывающую камеру и закрепите ее на месте с помощью экрана для арфы.
- Проведите теплым (35 °C) карбогенизированным перфузатом ACSF через записывающую камеру над срезом мозга со скоростью 3 мл/мин (~1 капля/с). Используйте цифровой термометр, чтобы убедиться, что температура в записывающей камере составляет 33–36°C.
- Стеклянные электроды с импедансом 1 - 3 МОм вытягиваются из трубки из боросиликатного стекла (с наружным диаметром 1,5 мм) с помощью съемника. Заполните стеклянные электроды ACSF (~10 μл) с помощью шприца Гамильтона. Немедленно выбросьте электрод, если наконечник поврежден.
Примечание: Отбелите серебряную проволоку (5 минут) и дайте погрузить только минимальную часть (, т.е. , кончик) серебряной проволоки в стеклянные электроды ACSF, заполненные обратной стороной, чтобы свести к минимуму шум и дрейф во время записи. При необходимости удалите излишки ACSF со стеклянного электрода с помощью шприца Hamilton.
- Используйте 20-кратный стереомикроскоп для точного наведения записывающего стеклянного электрода в поверхностный корковый слой (2/3) с помощью ручных манипуляторов. Записывайте/просматривайте электрическую активность среза мозга на компьютере со стандартным программным обеспечением.
Примечание: Жизнеспособные (высококачественные) срезы мозга будут демонстрировать устойчивый вызванный потенциал в ответ на приложенные электрические стимулы (100 μс, 30 - 300 μА) или световые импульсы (30 мс, 10 мВт/мм2) для оптогенетической ткани.
7. Индукция судорожных действий
- Перфузируйте ACSF, содержащий 100 мкМ 4-аминопиримидин (4-АП), над срезом мозга. Растворите 80 мг 4-AP в 8,5 мл воды, чтобы получить стоковый раствор 100 мМ 4-AP. Добавьте 100 мкл 100 мкл 100 мМ 4-AP стокового раствора к 100 мл ACSF, чтобы получить перфузат ACSF со 100 мкМ 4-AP.
Примечание: В качестве альтернативы, используйте Zero-Mg2+ ACSF (Table 3), модифицированный раствор ACSF, не содержащий добавленного Mg2+, для перфузии среза мозга. Среднее время появления иктальных событий составляет 15 минут; Однако для некоторых срезов мозга это может занять до 40 минут.
8. Генерация судорог по требованию: оптогенетическая стратегия для оптогенетических мышей
- Подайте короткий (30 мс) импульс синего (470 нм) света (с минимальной выходной интенсивностью 1 мВт/мм2) для инициирования иктального события. С помощью ручного манипулятора расположите оптическое волокно с диаметром сердцевины 1 000 мкм (0,39 NA) непосредственно над областью записи.
Примечание: Установите скорость фотостимуляции в соответствии с желаемой скоростью возникновения иктального события (т.е., 1 импульс каждые 50 с). Тем не менее, скорость не может быть чрезмерно преувеличена по сравнению с внутренней скоростью, с которой происходят иктальные события.
Таблица 1: Рецепт диссекционного раствора. Это инструкции по изготовлению томов объемом 1 л или 2 л. MW = молекулярная масса растворенного вещества.
| # | Реагент | Конc. [mM] | МВт (г/моль) | 1L (g) | 2L (g) |
| 1 | Сахароза | 248 | 342.3 | 84.89 | 169.78 |
| 2 | Бикарбонат натрия (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 2.18 | 4.37 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 1.8 | 3.6 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 2 | 74.55 | 0.15 | 0.3 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4·7H2O) | 3 | 246.47 | 0.74 | 1.48 |
| 6 | Моноосновной моногидрат фосфата натрия (H2NaPO4·H2O) | 1.25 | 137.99 | 0.17 | 0.34 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1 | 147.01 | 0.15 | 0.29 |
Таблица 2: Рецепт искусственной спинномозговой жидкости для грызунов (АСЦБ). Это инструкции по изготовлению томов объемом 2 л или 4 л. MW = молекулярная масса растворенного вещества.
| # | Реагент | Conc. [mM] | МВт (г/моль) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Хлорид натрия (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Бикарбонат натрия (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4·H2O) | 1.3 | 246.47 | 0.64 | 1.28 |
| 6 | Моноосновной моногидрат фосфата натрия (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.44 | 0.88 |
Таблица 3: Рецепт искусственной спинномозговой жидкости для грызунов Zero-Mg2+ (Zero-Mg2+ ACSF). Это инструкции по изготовлению томов объемом 2 л или 4 л. MW = молекулярная масса растворенного вещества.
| # | Реагент | Conc. [mM] | МВт (г/моль) | 2L (g) | 4L (g) |
| 1 | Хлорид натрия (NaCl) | 123 | 58.4 | 14.37 | 28.73 |
| 2 | Бикарбонат натрия (NaHCO2) | 26 | 84.01 | 4.37 | 8.74 |
| 3 | Декстроза (D-глюкоза) | 10 | 180.16 | 3.6 | 7.21 |
| 4 | Хлорид калия (KCl) | 4 | 74.55 | 0.6 | 1.19 |
| 5 | Сульфат магния (MgSO4·H2O) | Номинально свободный | 246.47 | 0 | 0 |
| 6 | Моноосновной моногидрат фосфата натрия (HNaPO4·H2O) | 1.2 | 137.99 | 0.33 | 0.66 |
| 7 | Хлорид кальция (CaCl2·2H2O) | 1.5 | 147.01 | 0.29 | 0.59 |
