Создание модели эпилептических припадков, индуцированных пентилентретразолом у мышей

Аннотация

Источник: Шимада, Т., et al. Модель мыши, индуцированной пентилентетразолом. J. Vis. Exp. (2018).

В этом видео демонстрируется процесс индуцирования эпилепсии у мышей с помощью инъекций пентилентетразола (PTZ), антагониста рецепторов ГАМК-А. Повторное внутрибрюшинное введение ПТЗ постепенно снижает порог судорог, подавляя приток ионов хлорида, нарушая тормозную нейротрансмиссию и приводя к гипервозбудимости нейронов, вызывающих судороги. Этот процесс приводит к разжиганию и развитию спонтанных припадков, имитирующих хроническую эпилепсию.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Получение Пентилентретразола (PTZ)

1. Растворите 2 мг/мл PTZ в стерильном 0,9% (w/v) NaCl. Подготовьте PTZ в день использования.

2. Впрыск PTZ

1. Проводите все эксперименты с 9:00 до 12:00 (полдень).
2. Измерьте массу тела животного.
3. Поместите животное в камеру наблюдения для приучения.
4. В течение периода привыкания (3 мин) рассчитайте объем раствора ПТЗ для инъекции исходя из массы тела животного и ранее определенной инъекционной дозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Например, при использовании 35 мг/кг PTZ, 0,875 мг PTZ требуется для мыши весом 25 г (35 мг/кг x 0,025 кг = 0,875 мг). Следовательно, следует вводить 437,5 мкл раствора PTZ в дозе 2 мг/мл (0,875 мг / 2 мг/мл = 0,4375 мл). Инъекционная доза ПТЗ зависит от генотипа и штамма мыши. Для мышей дикого типа C57BL/6 для первого испытания рекомендуется доза 30-35 мг PTZ/кг массы тела. Чувствительность к PTZ зависит от используемой деформации мыши. Доза инъекции варьируется в зависимости от цели эксперимента.
5. Введите PTZ внутрибрюшинно с помощью шприца объемом 1 мл, прикрепленного к игле 27-го калибра, в левый или правый квадрант брюшной полости животного. Избегайте инъекций по средней линии.
   1. Избегайте повторных инъекций в одном и том же положении.
6. Наблюдайте за поведением животных в течение 30 минут после введения PTZ (Рисунок 1A) и классифицируйте и оценивайте аномальное поведение, как показано ниже. Если возможно, держите животных под наблюдением в течение 24 часов или, по крайней мере, дополнительных 6-10 часов после инъекции, особенно после того, как оценка тяжести судорог достигнет 3 или выше.
   1. Обратите внимание на любые легкие припадки или изменения в поведении животных после 30-минутного периода наблюдения. Этот длительный период наблюдения может касаться особенно важного и полного эффекта субсудорожной дозы PTZ в возникновении хронических неспровоцированных припадков при эпилепсии.
   2. Кроме того, измеряйте продолжительность припадка при каждом наблюдаемом припадке, поскольку изменения в продолжительности припадка связаны с тяжестью припадка. Более того, латентность до первого приступа после инъекции PTZ является еще одним важным показателем, который необходимо собрать. Мониторинг частоты, продолжительности и латентности приступов имеет решающее значение для любых молекулярных исследований после припадков.
7. Вводите PTZ через день (Рисунок 1A). Количество инъекций зависит от цели эксперимента. Типичными примерами являются следующие.
   1. Чтобы получить полностью воспламененных животных, как только у животного начнутся припадки с оценкой 5 баллов (тонико-клонический припадок), завершите инъекцию еще через три введения. В этом случае увеличивают инъекционную дозу, если оценка судорог не увеличивается в течение трех последовательных введений. Каждое животное может получить разное количество и дозу PTZ-инъекций.
   2. Фиксировать количество и дозу инъекций PTZ в каждом состоянии для оценки уязвимости к PTZ, в том числе при оценке противоэпилептических препаратов и исследованиях фенотипа генетически модифицированных мышей. Сделайте всем животным одинаковое количество PTZ-инъекций; Всего рекомендуется от 8 до 12 инъекций. Если животное умирает, оценка судорог должна быть обозначена как 6.
   3. Определите инъекционную дозу, необходимую для поддержания высокого балла по шкале судорог (4 или 5) в течение 10 или более инъекций, чтобы изучить гистопатологические изменения, возникающие при эпилептических припадках. При этом общее количество инъекций должно составлять от 25 до 30. Уменьшите инъекционную дозу, если оценка судорог достигает 5. Если оценка судорог снижается до 3 или ниже, увеличьте инъекционную дозу.

Результаты

Рисунок 1: Краткое описание протокола. (А) Схематическое изображение PTZ-опосредованной растопки. (B) Иллюстрации репрезентативного поведения животных для соответствующих оценок судорог.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Пентилентретразол	Сигма-Олдрич	Р6500
Хлорид натрия	МАНАХ	7647-14-5
Мышь	CLEA Япония		C57Bl/6NJcl, послеродовой 8 недель, мужской
Шприц (1 мл)	Terumo	SS-01T
Игла (27G x 3/4") (0,40 x 19 мм)	Terumo	НН-2719С
Весы	Меттлер	ПЭ2000	Данный товар снят с производства. Почти эквивалент FX-2000i с FXi-12-JA от компании A&D.