Индуцирование ишемии через окклюзию среднего мозга и общей сонной артерии на модели крысы

Аннотация

Источник: Wayman, C. et al., Выполнение постоянной дистальной средней мозговой операции с окклюзией общей сонной артерии у пожилых крыс для изучения ишемии коры головного мозга с устойчивой инвалидностью. J. Vis. Exp. (2016)

В этом видео показана процедура выполнения постоянной дистальной окклюзии средней мозговой артерии, или MCAO, с общей сонной артерией, или лигирования CCA, у пожилых крыс для моделирования ишемического инсульта. Это блокирует приток крови к мозгу, что приводит к гибели нейронов и создает модель для изучения механизмов инсульта и потенциальных методов лечения.

Протокол

Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Хирургия

1. Используйте самок пожилых крыс в возрасте 16-18 месяцев (от 250 до 400 г) и вводите анестезию 5% изофлураном в дозе 1,5 л/мин O₂. После индукции анестезии уменьшите уровень изофлурана и поддерживайте его на адекватном, но минимальном уровне для хирургического вмешательства (, например, , 1,5-2%). Обезболивайте животное с помощью маски для лица и используйте систему очистки, чтобы ограничить воздействие изофлурана на хирурга.
   1. Выполняйте все процедуры до, но не включая трепанацию черепа у фиктивных животных, так как эта процедура может привести к поведенческому дефициту. Рассмотрите экспериментальные цели при планировании экспериментов по окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) и решите, следует ли включать фиктивную группу для контроля краниотомии.
2. Обезболивание до или в периоперационном периоде (Carprieve, 0,25 мг/кг, с. разрез).
   1. Добавьте 1 мл к 19 мл стерильного 0,9% физиологического раствора для приготовления исходного раствора и введите 0,6 мл на 300 г крысы. Использование Карприева предпочтительнее Карпрофена, потому что первый стабилен при комнатной температуре (ОТ).
3. Сбрейте шерсть в области брюшной шеи и височной области в правом полушарии, чтобы обнажить кожу. Продезинфицируйте места проведения операций с помощью тампонов из этанола.
   1. Выполняйте этот шаг в сторону от области операции, чтобы свести к минимуму количество шерсти в месте разреза.
4. Поместите крысу на пробковую доску, накрытую стерильной простыней, в лежачем положении на грелке. Нанесите крем с лидокаином на выбритые участки головы и шеи. Вставьте ректальный зонд для контроля и поддержания температуры животного в диапазоне 36,5-37,5 °C с помощью гомеотермической системы.
   1. Нанесите мазь Lacrilube на глаза, чтобы предотвратить высыхание. Дайте крысе инъекцию раствора сульфата атропина (0,05 мл раствора 600 мкг/мл, подкожно) для уменьшения секреции трахеи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи должны рассмотреть возможность измерения физиологических переменных, таких как газы крови и давление.
5. Перед началом операции проверьте отведение задних лап и мигательные рефлексы, чтобы подтвердить полную анестезию.
6. Под рассекающим микроскопом с помощью скальпеля сделайте центральный разрез по средней линии на открытой шее. Двигайте слюнные железы аккуратно латерально по отношению к трахее с обеих сторон.
7. Оберните нерассасывающимся шелковым швом кожу, которая с одной стороны перекрывает общую сонную артерию. Аккуратно оттяните кожу от участка с помощью шелкового шва и приклейте их к пробковой доске с помощью хирургической ленты, чтобы обнажить общую сонную артерию. Осторожно тупыми мышцами рассеките артерии, свободные от окружающей фасции и блуждающих нервов, с помощью тонких щипцов.
   1. Будьте осторожны, чтобы не повредить мышцы или блуждающие нервы во время этого шага, так как это ухудшит прием пищи, глотание и дыхание.
8. После того, как общая сонная артерия будет обнажена, используйте нерассасывающийся шелковый шовный материал (5/0), чтобы изолировать сонную артерию, сначала отделив сонную артерию от блуждающего нерва путем обратного рассечения тонкими щипцами и стараясь не соприкасаться с нервом. После того, как сосуд был запетлен (но не перевязан) шовной нитью, скрепите концы шовной нити хирургическим пластырем, чтобы предотвратить раскручивание этого этапа. Снимите швы, удерживающие вышележащую кожу.
9. Повторите для другой стороны.
10. Поместите в рану стерильную марлю, пропитанную солевым раствором, чтобы сохранить ткани влажными в течение оставшейся части операции. Неплотно зашите кожу и наложите на эту область дополнительную марлю, пропитанную солевым раствором, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание.
11. Поместите крыс в боковое положение и сделайте разрез на коже посередине между правой орбитой и наружным слуховым проходом. Втяните кожу с помощью пяти эластичных 3-миллиметровых крючковых ретракторов, прикрепленных к пробковой доске, а затем тупым образом рассеките височную мышцу, чтобы открыть череп.
12. Поместите отрегулированную с помощью большого пальца гравитационную капельницу над открытым местом (скорость потока примерно 2 мл/мин) и установите аспираторную систему для удаления костных остатков и устранения незначительного кровотечения из открытого участка на протяжении всей фазы операции.
    1. Поместите насадку для подачи физиологического раствора в самой высокой точке черепа рядом с ухом, а насадку для аспиратора — в самой низкой точке. Отрегулируйте колесо во время кровотечения, чтобы подавать больше физиологического раствора в эту область, чтобы лучше визуализировать источник любого кровотечения для прижигания сосуда, сокращая количество времени, в течение которого животные находятся под анестезией.
13. Выполните трепанацию черепа на открытой области (примерно 5 мм x 5 мм) с помощью стоматологической бормашины с крупным алмазным покрытием диаметром 1,6 мм при скорости около 8 000 об/мин, обеспечивая круговое и боковое давление, а не нисходящее давление во время сверления открытой области. Как только кость станет достаточно тонкой, чтобы выглядеть полностью прозрачной, удалите ее с помощью щипцов.
14. Используйте самодельный крючок для твердой мозговой оболочки, сделанный путем сгибания одного кончика тонких щипцов примерно на 180° для формирования дуги, чтобы осторожно открыть твердую мозговую оболочку, стараясь не задеть крупные кровеносные сосуды на поверхности, так как они хрупкие и легко разрываются.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаженная область мозга обнажит среднюю мозговую артерию (MCA); длина нужного сегмента составляет примерно 2 мм (см. Рисунок 1).
15. Коагулируйте МКА от места пересечения нижней мозговой вены до точки бифуркации артерии, а затем вдоль каудальных ветвей МКА с помощью пары диатермических щипцов до полной окклюзии. Используйте угловые диатермические щипцы Jeweller с заостренными наконечниками 0,25 мм.
    1. При закупорке артерии изменяйте поток физиологического раствора по мере необходимости, чтобы сохранить эту область прохладной, предотвращая прилипание коагуляционных щипцов к кровеносному сосуду. При окклюзии кровеносный сосуд выглядит черным, и никаких признаков кровотока не должно быть; В частично закупоренных сосудах может наблюдаться кровоток.
    2. Разрежьте MCA на этом этапе, чтобы подтвердить полную окклюзию. С помощью микрососудистых ножниц разрежьте ниже того места, где нижняя мозговая вена пересекает MCA.
    3. Накройте открытое место марлевой салфеткой, смоченной в физрастворе, прежде чем перейти к следующему шагу.
16. Поверните крысу обратно в лежачее положение и снова откройте слабо завязанный шов на шее, чтобы снова обнажить сонные артерии. Перевязать сонную артерию с той же стороны, что и окклюзированная МКА (справа), навсегда завязав узел в шелковом шве вокруг сонной артерии, в то время как левая сонная артерия временно окклюзируется с помощью артерийного зажима из нержавеющей стали диаметром 13 мм с давлением 125 g в течение 60 минут. За это время неплотно зашить разрез на шее и положить сверху стерильную марлю, пропитанную солевым раствором, чтобы предотвратить обезвоживание.
    1. Обратите внимание, что правая сторона животного будет находиться с левой стороны хирурга, учитывая положение лежа на спине.

Результаты

Рисунок 1. Хирургическая установка постоянной модели окклюзии дистальной средней мозговой артерии. Оборудование, используемое при установке для краниотомии крыс, показано для правого полушария и вставки, расположение аспиратора и капельница с физиологическим раствором вокруг места краниэктомии. Также показаны ключевые особенности сосудистой системы; Показана средняя мозговая артерия (красная) и нижн...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Карпрофен	Норбрук	ВМ No; 02000/4229	дают 0,25 мг/кг
Сульфат атропина	АмТех	RXATRINJ-100
Спиртовые тампоны	ЭХС	20021
Лидокаин крем (Emla)	АстраЗенека	12901	Нанесите каплю размером с горошину на выбритую шею и височную область
Гомеотермическая система одеяла	Инструменты Гарварда	507222F
Щипцы	Инструменты изобразительной науки	11019-12
Изофлуран	Эбботт	В506
Шелковые швы	Гарвардский аппарат	723288
Система прижигания	Эшманн
0,25 мм щипцы для кауртерной кауртерии	Эшманн	8330349
тонкие щипцы Дюмона	Инструменты изобразительной науки	11251-10
Капельная система с ручным приводом
Вакуумная аспираторная система	INTEGRA BIOSCIENCES	158320
16 мм крупнозернистые алмазные жернова		К801 104 016
Ручная бормашина	NSK	NSKVMAXVRE (Наконечник NSKEX6B)
Весенние ножницы Ваннас	Инструменты изобразительной науки	15000-03
Микрососудистые ножницы	Мировые прецизионные приборы	501790
4-0 Викриловые швы	Этикон
Сосудистый зажим и аппликатор
Операционный микроскоп	Zeiss
Компактная анестезиологическая система изофлуран к/ф одиночный газ	Решения VetTech
Лезвия скальпеля из углеродистой стали No 10	Свонн-Мортон	201
25 г иглы	Terumo	НН-2525Р
Шприцы (1 мл и 5 мл)	Terumo	SS+01T1 / SS*05SE1
Физиологический раствор (хлорид натрия 0,9%)	Фрезениус Каби	Пл 08828/0178
Ватные палочки	Джонсон и Джонсон	5.00021E+12	стерилизуйте перед использованием
Марля			стерилизуйте перед использованием