Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Подготовьте шприц для инъекции
- Лизолецитин растворить в 1% растворе в фосфатно-солевом буфере (PBS; pH 7,4) и хранить при -20 °C в небольших аликвотах (75 μл). Разморозьте флакон до комнатной температуры (RT).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если лизолецитин не растворен, проведите ультразвуковую обработку трубки в ультразвуковом очистителе (40 кГц) в течение примерно 30 минут, чтобы получить однородный раствор.
- Обращайтесь с предварительно вытянутым стеклянным капилляром с особой осторожностью, чтобы не повредить нежный кончик. Открутите гайку инъекционного шприца объемом 10 мкл и наденьте его на плоский конец капилляра, а затем на два наконечника, следя за тем, чтобы сопрягаемые концы наконечников совпадали, а капилляр плотно прилегал к коническому наконечнику (Рисунок 1). Промойте шприц изопропиловым спиртом и снимите поршень. После высыхания плотно прикрутите узел иглы к шприцу для инъекций.
- Прикрепите металлическую иглу ступицы к грунтовочному шприцу. Проткните иглой резиновый диск и сдвиньте его вниз к основанию. Наполните грунтовочный шприц лизолецитином. Осторожно надавите на грунтовочный шприц до тех пор, пока на кончике иглы не станет видна жидкость. Это гарантирует, что пузырьки воздуха не будут вводиться в шприц для инъекций.
- Вставьте металлическую иглу ступицы грунтовочного шприца в шприц для инъекций. Сделав прочное уплотнение резиновым диском, медленно надавите на грунтовочный шприц до тех пор, пока капилляр не заполнит наконечник раствором. Осторожно извлеките грунтовочный шприц с одновременным нажатием, чтобы заполнить цилиндр инъекционного шприца без введения пузырьков воздуха. Вставьте поршень в шприц для инъекций и убедитесь, что раствор течет из кончика капилляра при легком нажатии на поршень.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если в капиллярном или инъекционном шприце видны пузырьки воздуха, приготовление шприца необходимо повторить с самого начала. Непрерывная подача жидкости в инжекционный аппарат имеет решающее значение для обеспечения точных объемов впрыска.
- Прикрепите готовый инъекционный шприц к руке стереотаксического микроманипулятора. Этот готовый аппарат сможет вводить 15-20 животных, прежде чем его нужно будет заправлять.
- Выбросьте оставшийся лизолецитин из шприца для грунтовки. Извлеките и нажмите изопропиловый спирт несколько раз, а также отсоедините металлическую иглу ступицы. Подождите несколько часов, пока оставшийся изопропиловый спирт в грунтовочном шприце испарится, прежде чем заполнять его снова.
2. Подготовьте животное к хирургическому вмешательству
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура описана для самок мышей C57BL/6 в возрасте 8-10 недель.
- Обезболивайте животное внутрибрюшинной инъекцией кетамина (200 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг) или в соответствии с правилами институционального ухода за животными. Планируйте, что животное будет находиться под анестезией в течение примерно 1 часа при использовании инъекционной анестезии.
- Проверьте, что животное глубоко обезболито, сильно зажав ногу. Животное, находящееся под надлежащим обезболиванием, не будет реагировать на щипки.
- С помощью машинки для стрижки сбрейте участок размером 2-3 см2 на спинной стороне животного, ближе к ушам. Будьте осторожны, чтобы не повредить уши.
- Протрите участок 70% этанолом, нанесенным на марлевую салфетку. Убедитесь, что все подстриженные волосы были удалены с этой области. Продезинфицируйте участок йодом.
- Нанесите вазелин на глаза, чтобы не допустить пересыхания на протяжении всей процедуры.
- Держите животное в отапливаемой восстановительной камере до тех пор, пока не будет готово начать процедуру.
3. Выполните хирургическую процедуру
ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте надлежащую асептическую технику для всех этапов процедуры. Это включает в себя правильное использование перчаток, сеток для волос, масок и портьер. Все инструменты должны быть стерилизованы перед контактом с животным.
- Переместите животное в стереотаксическую раму, спинной стороной вверх, приподнятую в средней части сложенными бумажными полотенцами, чтобы увеличить кривизну позвоночника. Закрепите руки и хвост хирургическим скотчем и закрепите голову зубчатым зажимом. Для этой процедуры не нужны стабилизирующие ушные планки.
- С помощью скальпеля сделайте разрез по средней линии длиной 3 см, начиная чуть ниже ушей и разрезая в каудальном направлении.
- Найдите разрыв между двумя крупными жировыми структурами и используйте тонкие щипцы в каждой руке, чтобы раздвинуть их. Разложите ретракторы, чтобы открыть операционное поле.
- Под хирургическим микроскопом найдите выступающий отросток позвонка грудного позвонка 2 (T2) (ПРИМЕЧАНИЕ: Эта особенность характерна для линии мышей C57BL/6). Выполните тупое рассечение ножницами с закрытой пружиной через перекрывающую мускулатуру, чтобы лучше визуализировать T2. С помощью щипцов нащупайте твердые поверхности грудного позвонка 3 (T3) и грудного позвонка 4 (T4), чтобы подтвердить правильное анатомическое положение.
- С помощью пружинных ножниц сделайте неглубокие боковые надрезы (глубиной 2-3 мм) соединительной ткани между Т3 и Т4. Из-за естественного расстояния между позвонками в верхней грудной части позвоночного столба мыши нет необходимости в ламинэктомии для выявления спинного мозга. Имейте в виду, что слишком глубокий порез может проколоть и повредить шнур.
ПРИМЕЧАНИЕ: Небольшая степень кровотечения является обычным явлением на этом этапе. Если это произошло, проведите губчатым копьем в эту область, пока кровотечение не утихнет (30-60 сек).
- Визуализируйте спинной мозг. Он будет покрыт толстым слоем видимой твердой мозговой оболочки, если этот менингеальный слой еще не разрезать во время обнажения спинного мозга. Выступающий кровеносный сосуд проходит каудально/рострально через приблизительную среднюю линию спинного мозга.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эту сосудистую сеть не следует использовать в качестве ориентира для средней линии. Вместо этого достаточное освещение должно выявлять границы серо-белого вещества, фланкирующие спинной столбик, которые следует использовать для оценки средней линии.
- Если твердая мозговая оболочка осталась неповрежденной, сделайте легкие боковые соскабливания металлической иглой 32 G до тех пор, пока она не будет очищена. Цель состоит в том, чтобы удалить твердую мозговую оболочку, не разрезая при этом оставшиеся нижележащие мозговые оболочки, которые не такие толстые и их труднее увидеть.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение спинномозговой жидкости указывает на нарушение паутинного ствола, и хотя это может произойти без механического повреждения ткани, скопившуюся спинномозговую жидкость следует удалить с помощью губчатого копья, чтобы лучше визуализировать поверхность спинного мозга.
- Переместите шприц для инъекций на место и медленно опустите его до тех пор, пока кончик капилляра едва коснется спинного мозга, расположенного непосредственно сбоку от обеих сторон средней линии. Зафиксируйте руку на месте.
- Используйте градуированные измерения стереотаксического манипулятора Z-направления для измерения базового положения. Из этого показания вычтите 1,3 мм. Быстрыми и неглубокими движениями вниз проткните ткань и осторожно опустите капилляр до тех пор, пока не будет достигнуто новое измерение. Дополнительно: при желании поражения в дорсальной колонне могут быть вызваны тем же колющим движением по средней линии и глубиной 0,3 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти значения специфичны для инъекции между T3 и T4. Если вы решили выполнить инъекцию в любом другом месте спинного мозга, эти значения должны быть получены из любого доступного атласа мозга мыши.
- С помощью микроманипулятора вдавливают лизолецитин в вентральное белое вещество спинного мозга. Совершайте один оборот микроманипулятора каждые 5 секунд в течение 2 минут, в результате чего конечный объем составит 0,5 μл. Оставьте капилляр на месте еще на 2 минуты, чтобы предотвратить обратный поток раствора, а затем осторожно удалите капилляр.
- Завяжите один шов в мышечной/жировой ткани, перекрывающей позвоночный столб. Используйте непрерывный шов, чтобы закрыть кожу. Нанесите на место разреза больше йода.
- Поместите животное в нагретую камеру восстановления, пока оно не придет в себя, затем верните его в клетку. Применяйте анальгетики после операции в соответствии с правилами ухода за животными в учреждении. Дополнительный послеоперационный уход обычно не требуется, так как животные полностью передвижены и способны самостоятельно есть и пить, как только они восстановятся после анестезии.
- Повторите процедуру для остальных животных.
ПРИМЕЧАНИЕ: При наличии опыта, операция может быть завершена за 10-15 минут на животное, особенно с помощью второго человека, накладывающего швы. Один и тот же стеклянный капилляр можно использовать примерно для 15-20 операций, прежде чем наконечник затупится и его следует заменить. Контрольные операции могут быть выполнены идентично описанному, с инъекцией PBS в спинной мозг вместо лизолецитина. Мы не рекомендуем чистить капилляры впрок.
