Индуцирование целевого повреждения нейронов с помощью мощного лазера у личинки дрозофилы

Аннотация

Источник: Li, D., Li, F., et al. A Модель повреждения дрозофилы in vivo для изучения нейрорегенерации в периферической и центральной нервной системе. J. vis. exp. (2018)

В этом видео демонстрируется метод индуцирования целевого повреждения нейронов у личинок Drosophila с использованием мощного лазера. После позиционирования личинки под микроскопом маломощный лазер сканирует флуоресцентные нейроны, а затем мощность лазера увеличивается, чтобы вызвать локализованное повреждение. Травма подтверждается повышенной флуоресценцией и кратером в месте травмы.

Протокол

1. Двухфотонная травма и конфокальная визуализация

1. Настройка микроскопа
   Примечание: Для этого эксперимента был использован конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с двухфотонным лазером, но других систем с эквивалентной установкой также будет достаточно. Двухфотонный лазер (930 нм) был использован для доставки травмы, а аргоновый лазер (488 нм) был использован для конфокальной визуализации GFP.
   1. В начале каждого сеанса включайте двухфотонный лазер и/или конфокальный лазер (лазеры) и микроскоп. Затем откройте программное обеспечение для обработки изображений.
   2. Для двухфотонной травмы настройте следующие параметры для визуализации GFP с помощью двухфотонного лазера на длине волны 930 нм (1950 мВт).
      1. Выберите режим линейного сканирования. Откройте отверстие до упора. Увеличьте интенсивность лазера до ~20% (390 мВт).
      2. Выберите 512 x 512 в качестве кадрового сканирования. Используйте максимальную скорость сканирования (обычно с временем задержки пикселя 0,77 мкс). Убедитесь, что среднее число равно 1, а разрядность — 8 бит.
      3. Установите усиление на ~750, а смещение на 0.
      4. Сохраните этот предустановленный экспериментальный протокол в качестве абляции 2P GFP 930, что позволит легко использовать его в будущих экспериментах.
   3. Для конфокальной визуализации необходимо настроить следующие параметры визуализации GFP с помощью аргонового лазера на длине волны 488 нм:
      1. Выберите вкладку Acquisition (Приобретение), а затем Z-stack (Z-stack).
      2. В разделе "Laser" включите питание для аргонового лазера с длиной волны 488 нм.
      3. Перейдите в раздел «Каналы», выберите лазер 488 мм и увеличьте мощность лазера до 5-10%. Для отверстия используйте 1-2 воздушные единицы (AU). Отрегулируйте усиление на 650.
      4. В режиме съемки выберите 1024 x 1024 в качестве сканирования кадра, используйте максимальную скорость сканирования, среднее число 2 и битовую глубину 8 бит.
      5. Сохраните этот предустановленный экспериментальный протокол как визуализация GFP (зеленый флуоресцентный белок).
2. Обезболивание личинок диэтиловым эфиром и монтирование
   1. В вытяжной шкаф поместите стеклянную тарелку диаметром 60 мм в пластиковую чашку Петри диаметром 15 см. Сложите и постелите на дно стеклянной посуды лист папиросной бумаги, затем положите на ткань пластину с агаром виноградного сока. Добавьте диэтиловый эфир в стеклянную посуду до такой степени, чтобы папиросная бумага пропиталась и в посуде остался слой жидкого эфира. Всегда держите крышку закрытой.
   2. Подготовьте предметное стекло с одной каплей масла галоидоуглерод 27 в центре. Добавьте 4 пятна вакуумной смазки на четыре угла предметного стекла, чтобы позже поддержать покровное стекло.
   3. С помощью щипцов возьмите очищенную личинку и поместите ее на агаровую пластину в стеклянную посуду диаметром 60 мм. Накройте стеклянную посуду крышкой и подождите, пока личинка перестанет двигаться. Для получения травмы/визуализации ПНС удалите личинку, как только ее хвост перестанет дергаться. Для ЦНС дождитесь, пока вся личинка станет неподвижной, особенно головные сегменты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время воздействия эфира имеет решающее значение. Смотрите обсуждение.
   4. Осторожно возьмите в руки личинку, находящуюся под наркозом, и поместите ее вертикально в каплю галоидоуглеродного масла на предметном стекле. Добавьте покровную крышку в верхней части предметного стекла. Слегка надавите на покровное стекло, пока оно не коснется личинки (Рисунок 1A).
   5. Отрегулируйте положение личинки, осторожно надавливая покровное стекло влево или вправо, чтобы перекатить личинку так, чтобы интересующий вас нейрон/аксон/дендрит находился сверху и ближе всего к линзе микроскопа.
   6. При повреждении ПНС установите личинку спинной стороной вверх так, чтобы были видны обе трахеи. Затем поверните личинку на ~30 градусов влево для повреждения аксонов da класса III (рис. 1B и 1C), на 90 градусов для повреждения аксонов da класса IV (рис. 1B и 1E), или на ~30 градусов для повреждения дендритов da класса IV.
   7. При повреждении ЦНС расположите личинку идеально вентральной стороной вверх так, чтобы исследуемая область была ближе всего к линзе микроскопа в z-плоскости.
3. Травма двухфотонным лазером
   1. Поместите предметное стекло с личинкой под микроскоп и закрепите его на месте с помощью держателя предметного стекла на предметном столике. Используйте цель 10X (0,3 NA), чтобы найти личинку.
   2. Добавьте 1 каплю объективного масла на покровное стекло, переключитесь на объектив 40X (1,3 NA) и отрегулируйте фокусировку.
   3. Переключитесь в режим сканирования и повторно используйте экспериментальный протокол 2P GFP 930 Ablation. Убедитесь, что отверстие полностью открыто.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация должна быть оптимизирована в зависимости от отдельных систем.
   4. Запустите режим реального времени, чтобы определить интересующую область (ROI), и выполните тонкую настройку параметров, чтобы добиться хорошего качества изображения при соответствующем увеличении.
      Примечание: Цель этого шага состоит в том, чтобы найти нейрон/аксон/дендрит для повреждения, а не получить изображение наилучшего качества. Поэтому используйте минимальные настройки, достаточные для визуализации целевой области, во избежание пересвета или фотообесцвечивания.
   5. Остановите сканирование в реальном времени, чтобы кнопка «Обрезать» стала доступна. Пусть неподвижное изображение послужит дорожной картой. Выберите функцию «Кадрирование» и настройте окно сканирования, чтобы сфокусироваться на цели, которую нужно ранить.
   6. Уменьшите ROI до размера предполагаемого места травмы. Например, просто закройте ширину аксона или дендрита, чтобы обеспечить точность травмирования и уменьшить повреждение соседних тканей. При желании увеличьте рентабельность инвестиций перед обрезкой, что позволит более точно наносить травмы.
   7. Откройте новое окно изображения. Уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Определение увеличения интенсивности лазера на основе сигнала флуоресценции тканей, отсканированного в режиме Live.
   8. Как правило, устанавливают интенсивность двухфотонного лазера, начиная от 25% для повреждения ПНС и 50-100% для повреждения ВНК. При повреждении аксонов ПНС убедитесь, что интенсивность лазера составляет ~480 мВт, а время задержки пикселей — 8,19 мкс. Для повреждения аксонов VNC убедитесь, что интенсивность лазера и время задержки пикселей обычно составляют 965-1930 мВт и 8,19-32,77 μс соответственно.
   9. Запустите непрерывное сканирование. Оставьте курсор наведенным на кнопку Непрерывно. Внимательно следите за изображением и остановите сканирование, как только будет замечено резкое увеличение флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появление всплеска флуоресценции обусловлено аутофлуоресценцией в месте травмы.
   10. Переключитесь обратно в режим Live, повторно используя настройки. Найдите область интереса, которая только что была выбрана, настроив фокус.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошим признаком успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцеобразной структуры или локализованных обломков прямо на месте травмы.
   11. Перейдите к следующему нейрону и повторите шаг 1.3.5, чтобы повредить несколько нейронов у одного животного. Или повторите шаг 3.3.5, постепенно увеличивая мощность и/или уменьшая скорость сканирования, если первоначальная травма была недостаточной.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если мощность лазера слишком высока, на снимке сканирования в реальном времени после травмы будет видна большая поврежденная область. Слишком сильная травма может стать причиной гибели личинки.
   12. Восстановите личинку, осторожно сняв покровный листок и переложив поврежденную личинку на новую пластину с дрожжевой пастой. Вырыть несколько пещер на агаровой плите щипцами; В качестве альтернативы сделайте островок из агара в тарелке вместо использования всей тарелки, чтобы уменьшить возможность выползания личинки из тарелки.
   13. Поместите планшет в 60-миллиметровую чашку Петри с влажной салфеткой (смоченной 0,5% раствором пропионовой кислоты) и заквашивайте при комнатной температуре или 25°C.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Личинка будет оставаться в личиночной стадии примерно в течение дополнительных суток при комнатной температуре (22°C) по сравнению с 25°C.

Результаты

Рисунок 1: Регенерация аксонов нейронов Da на периферии демонстрирует классовую специфичность. (А и В) Схематический рисунок, показывающий положение личинок. (В) Схематический рисунок нейронов класса III da. (D) Аксоны нейронов ddaF класса III, помеченные 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, не восстанавливаются. (E) Схематический рисунок нейронов класса IV da. (F) Аксоны нейронов класса IV da ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Диэтиловый эфир, реагент ACS, безводный	Акрос Органикс	AC615080010
Галокарбон 27 Масло	Genesee Scientific	59-133
Фосфатно-солевой буфер (PBS), 20x концентрат, pH 7,5, поставщик # E703-1L	VWR	97062-948
Порошок агара, Alfa Aesar, 500GM	VWR	AAA10752-36
Виноградный сок	Уэлч
Этанол 95% (спирт реагента 95%)	VWR	64-17-5
Уксусная кислота	Сигма-Олдрич	А6283
Пропионовая кислота	Дж.Т.Бейкер	U33007
Защитные очки: прямоугольники	Научный Фишер	12-544-D	50 мм X 22 мм
Лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 880	Zeiss
Программы дзен	Zeiss
Хамелеон Ультра II	Coherent