1. Приготовление сред и реагентов
- Разморозьте покрытие матрицы базальной мембраны для культуральных пластин при температуре 4 °C (не допускайте нагрева матрицы базальной мембраны, иначе она затвердеет). Приготовьте 1 мл аликвот и храните их при температуре -20 °C или -70 °C.
- Восстановите основной фактор роста фибробластов (bFGF) в стерильном фосфатно-солевом буфере (PBS) в концентрации 10 мкг/мл и получите аликвоты 10 мкл. Храните их при температуре 4 °C.
- В новый, неоткрытый флакон объемом 500 мл DMEM/F12 с глутамином добавьте B27 (10 мл), N2 (5 мл) и пенициллин-стрептомицин (5 мл). Поместите 50 мл этой среды нейральных стволовых клеток (НСК) в коническую пробирку и добавьте 10 мкл 10 мкг/мкл (2 мкг/мл конечный) bFGF. Храните среду NSC (+) bFGF при температуре 4 °C.
- Чтобы приготовить (-) фильтрующий материал bFGF, используйте тот же рецепт, что и в шаге 1.3, но не добавляйте bFGF. Эта среда будет использоваться для дифференцировки НСК в нейроны и для поддержания культур нейронов после дифференцировки.
2. Лентивирусные конструкции
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом работы с лентивирусными конструкциями, убедитесь, что лаборатория одобрена для использования агентов уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Кроме того, при работе с лентивирусными векторами необходимо использовать капюшоны для культур BSL-2, средства индивидуальной защиты (СИЗ) и методы утилизации.
- Получите тау-конструкции, упакованные в лентивирус, из предпочтительного источника.
3. Культивирование нервных стволовых клеток человека
ПРИМЕЧАНИЕ: НСК обычно засеваются со скоростью 100 000–150 000 клеток/см2, и большинство коммерчески доступных НСК продаются как 1 x 106 клеток/флакон. Этот протокол был оптимизирован для 10-сантиметровых тарелок для клеточных культур (хотя могут использоваться и другие размеры чашек); Таким образом, если используются коммерчески доступные НСК, их может потребоваться расширить путем их культивирования в шестилуночных чашках, чтобы получить достаточное количество клеток для засеивания 10-сантиметровых чашек. В качестве альтернативы этот протокол может быть адаптирован для различных размеров чашек для клеточных культур.
- Для приготовления планшетов для клеточных культур удалите одну аликвоту замороженного покрытия матрицы базальной мембраны для планшетов для клеточных культур и дайте ей оттаять при 4 °C (аликвоты можно поместить при 4 °C на ночь за день до посева клеток). Добавьте 385 мкл матричного покрытия базальной мембраны к 5 мл среды DMEM/F12 + пенициллин-стрептомицин.
ПРИМЕЧАНИЕ: 5 мл среды DMEM/F12 + пенициллин-стрептомицин достаточно для покрытия одной чашки диаметром 10 см (1 мл этого раствора для покрытия базальной мембраны достаточно для покрытия одной лунки шестилуночной чашки). В качестве альтернативы, если клетки должны быть зафиксированы и иммуноокрашены или окрашены на тиофлавин, культивируйте клетки на стеклянных покровных стеклах в 24-луночных чашках для культивирования.
- Держите среду и матричное покрытие в холодном месте до и во время добавления их в чашки для культур. Добавьте покрытие матрицы базальной мембраны в чашки для культур и поместите чашки в инкубатор (при температуре 37 °C) на 1 час. Для получения оптимального покрытия не инкубируйте матрицу базальной мембраны более или менее 1 часа. Через 1 ч аспирировать покрытие матрицы базальной мембраны из чашек с клеточными культурами. Убедитесь, что это совпадает с готовностью NSC к нанесению покрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки не размораживают из замороженных запасов, пропустите шаг 3.2 и перейдите к шагу 3.3.
- Если происходит размораживание клеток из замороженных запасов НСК, возьмите флакон с замороженными клетками и согрейте его на водяной бане, нагретой до 37 °С, перемещая флакон туда-сюда в воде. После размораживания распылите на флакон 70% этанола и поместите его в колпак для клеточных культур. Перенесите клетки в ~10 мл среды DMEM/F12 + пенициллин-стрептомицин и центрифугируйте пробирку при комнатной температуре при 1000 x g в течение 5 минут. Аспирируйте среду и ресуспендируйте клетки в средах НСК.
- Разбавьте клетки в среде НСК для получения соответствующей плотности посева для используемого сосуда для клеточной культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если NSC наносятся на шестилуночный планшет — одна лунка на шестилуночном планшете имеет площадь поверхности 9 см2—требуется от 900 000 до 1 350 000 клеток для затравки. Таким образом, один флакон, содержащий 1 000 000 клеток, может быть ресуспендирован в 2 мл среды и добавлен в одну лунку шестилуночной чашки.
- Добавьте достаточное количество клеток, взвешенных в среде NSC, чтобы засеять чашки для культур, покрытых базальной мембраной (100 000 клеток/см2) и меняйте среду через день (если вы используете замороженный материал, меняйте среду на следующий день после нанесения покрытия и через день после этого). Выращивайте клетки до тех пор, пока они не станут сливающимися на 75–80%.
ПРИМЕЧАНИЕ: Вскоре после нанесения покрытий ячейки, скорее всего, достигнут 75%-80% слияния, но это может занять больше времени, если используются замороженные запасы.
- После того как НСК слились на 75–80%, начните дифференцировку нейронов путем удаления среды NSC (+) bFGF и замены ее на среду NSC (-) bFGF. Культивируйте клетки в этой среде (заменяя среду через день) в течение не менее 4 недель.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки будут продолжать делиться в течение нескольких дней после вывода bFGF; Таким образом, клетки могут достигать 90–100% слияния.
- После культивирования в течение 4 недель клетки достигнут нейронной судьбы и будут готовы к лечению лентивирусом.
4. Трансдукция и поддержание культур нейронов
- Для трансдукции нейронов лентивирусом используйте титр 3,4 x 105 трансдуцируемых единиц на клетку (100% сливающаяся 10-сантиметровая чашка будет содержать ~10 миллионов нейронов). Развести трансдуцируемые единицы до необходимой концентрации в средах для клеточных культур и добавить их в клетки (используйте нормальный объем среды для чашки для культивирования клеток). Через два дня после добавления лентивируса промойте клетки 1x свежей (-) средой bFGF (без лентивируса) и продолжайте культивирование в (-) среде bFGF как обычно.
- Для постлентивирусного лечения питайте трансдуцированные нейроны, меняя среды для культивирования клеток ([-] bFGF) через день. Сохраняйте клетки в течение ~8 недель после трансдукции. Регулярно визуализируйте клетки под световым микроскопом, чтобы убедиться в их жизнеспособности.
ПРИМЕЧАНИЕ: Разреженность или дендритные поломки являются признаками того, что клетки больше не жизнеспособны.
