Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным наблюдательным советом JoVE.
1. Приготовления
- Модифицируйте катетер периферических вен 16 G для интубации. Чтобы модифицировать, укоротите иглу на 1 см и согните оставшуюся дистальную часть на 1 см на 30° в сторону инъекционного клапана. Снимите крылья катетера (многократного использования).
- Чтобы изготовить зонд внутричерепного давления или ВЧД, отрежьте кусок полиэтиленовой трубки диаметром 20 мм (внутренний диаметр (ID): 0,58 мм, внешний диаметр (OD): 0,96 мм) и обожгите один конец, чтобы получилась круглая пластина, сохраняющая открытый просвет. Обойдите полиэтиленовую трубку силиконовой трубкой толщиной 1 мм (внутренний диаметр: 1,0 мм, внешний диаметр: 3,0 мм) перед подсоединением 10 мм силиконовой трубки (внутренний диаметр: 0,76 мм, внешний диаметр: 2,4 мм) к концу полиэтиленовой трубки.
- Включите ноутбук и откройте программное обеспечение для сбора данных. Откалибруйте датчики артериального давления (АД) и внутримозгового давления (ВЧД) и лазерный допплер в соответствии с инструкциями производителя.
- Подготовьте аппарат газоанализатора крови.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что в вапорайзере достаточно изофлурана.
- Включите O2 и поток атмосферного воздуха. Установите расход O2 на 30% и атмосферного воздуха на 70%.
- Поместите грелку и установите температуру 37 °C.
2. Анестезия
- Поместите крысу в анестезиологическую камеру с потоком 30% O2 и 70% атмосферного воздуха. Ввести в камеру 5% газа изофлурана. Адекватная анестезия займет около 4 минут. Тщательно контролируйте дыхание.
- Под наркозом поместите крысу в лежачем положении на плотную пластину, обтянутую резиновой лентой. Поместите передние зубы крысы ниже резинки.
- Осторожно вытяните язык изогнутыми щипцами. Очистите гортань ватным наконечником. Поместите внешний свет на среднюю линию горла, чтобы визуализировать голосовые связки.
- Интубируйте во время вдоха с помощью модифицированного катетера периферических вен 16 G. При правильной установке снимите стилет. Подключите катетер к аппарату искусственной вентиляции легких.
ПРИМЕЧАНИЕ: Правильное расположение трубки подтверждается движениями грудной клетки, синхронизированными с частотой дыхания. Если видны движения живота, экстубируйте и снова введите крысу в колокол для анестезии. Не повторяйте процедуру более трех раз из-за риска повредить дыхательные пути.
- После интубации животное следует держать на искусственном дыхании с 30% O2 и 70% атмосферного воздуха. Поддерживайте анестезию на уровне 1,5%-3% изофлурана. Отрегулируйте изофлуран, чтобы поддерживать артериальное давление в пределах 80-100 мм рт.ст.
- Поддерживайте объем вдоха респиратора на уровне 3 мл и частоту 40-45 вдохов/мин. Отрегулируйте объем вдоха в соответствии с анализом газов крови.
- Сделайте шов через внутренние мягкие ткани щеки с помощью шва 2-0. Завяжите шов вокруг инъекционной трубки и инъекционного клапана катетера периферических вен, чтобы закрепить катетер.
- Переместите крысу на операционное поле и положите ее в положение лежа на спине хвостом к хирургу.
- Наносите гель для глаз при необходимости для борьбы с сухостью глаз.
- Выполните щипнение пальцев ног, чтобы подтвердить достаточную глубину анестезии. Оценка и поддержание глубины анестезии во время операции.
3. Хвостовой катетер
- Продезинфицируйте проксимальные 3-4 см хвоста 0,5% хлоргексидина этанола.
ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента используйте хирургический микроскоп на усмотрение хирурга.
- Сделайте надрез кожи на 15-20 мм в проксимальном конце хвоста с вентральной стороны. Будьте осторожны, чтобы не перерезать артерию.
- Отделите кожу от подлежащей соединительной ткани с помощью изогнутых щипцов.
- Осторожно проникайте в фасцию, обнажая артерию.
- Аккуратно освободите хвостовую артерию от подлежащих тканей с помощью изогнутых щипцов.
- Проденьте под сосуд три черные шелковые нити. Расположите одну нить как можно дальше и плотно завяжите хирургический узел вокруг артерии. Закрепите свободные концы нити гемостатом.
- Свободно завяжите две оставшиеся нити вокруг артерии.
- Протолкните проксимальную нить как можно проксимальнее. Наложите кровоостанавливающее средство, чтобы удерживать концы проксимальной нити. Потяните кровоостанавливатель слегка, но достаточно, чтобы ограничить и перекрыть кровоток. Поместите кровоостанавливающее средство на живот.
- Разрежьте кончик катетера под углом 45°. Разрежьте острый конец, чтобы предотвратить проникновение артериальной стенки.
- С помощью ножниц «Ваннас» сделайте разрез артерии на 1/3 диаметра артерии под углом 30°, на расстоянии 3-5 мм от дистального узла.
- Введите катетер в артерию с помощью двух прямых щипцов. Используйте один щипец для удержания катетера, а другой — для осторожного натягивания артерии на катетер.
- Вставьте катетер вверх по сосуду к проксимальному узлу и ослабьте узел от гемостатика. Визуализируйте кровоток в катетере. Свободно закрепите среднюю нить на катетере.
- Продолжайте введение до и, если возможно, сразу за той точкой, где артерия снова покрыта фасцией.
- Контролируйте размещение катетера и возможную утечку путем промывания физиологическим раствором.
- Закрепите две проксимальные нити с помощью хирургических узлов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Измерение артериального давления должно быть пульсирующим; В противном случае катетер установлен неправильно.
- Закрепите катетер в конце разреза, завязав хирургический узел с помощью дистальной нити.
- Сшейте разрез кожи неплотно между собой двумя нерассасывающимися мононитями 4-0 швами. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть внутрь катетера.
ПРИМЕЧАНИЕ: На протяжении всей операции следите за амплитудой пульсации. Если он низкий, промойте катетер физиологическим раствором.
- Ослабьте артериальный катетер от датчика давления, чтобы обеспечить приток крови для забора газов крови. Поместите микрокапиллярную трубку в конец катетера. Дайте крови потечь в трубку. После сбора крови катетер снова прикрепите к датчику и промойте катетер.
- Вставьте капиллярную трубку в газоанализатор крови. Измерьте pH, pCO2 и pO2 и запишите их
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от значений газа крови и артериального давления, измените скорость вентиляции. Если среднее артериальное давление (MAP) слишком низкое, попробуйте уменьшить скорость потока изофлурана. Проверьте рефлексы, чтобы убедиться в правильной глубине анестезии.
4. Зонд ICP
- Поместите крысу в стереотаксическую рамку. Важно расположить крысу симметрично.
- Поместите цилиндрическую подушку под стереотаксическую раму, чтобы создать переднее сгибание шеи.
- Выбрейте кожу головы, шею и область за ушами крысы. Удалите лишние волосы.
- Продезинфицируйте участок с помощью 0,5% хлоргексидина этанола.
- Местно обезболить 0,7 мл 10 мг/5 мкг/мл лидокаина с адреналином, ввести иглу в каудальный конец черепа по средней линии. Вводите в мускулатуру шеи с 0,3-0,4 мл. Оставшуюся часть вводите подкожно вокруг брегмы и впереди нее.
- Сделайте надрез кожи от прокола иглой ~8 мм каудально по средней линии.
- Рассеките все мышцы тупо слоями, чтобы определить атлантозатылочную мембрану (треугольник мраморного цвета каудально к черепу по средней линии).
- Используйте ретрактор Alm для ограничения мускулатуры шеи. При необходимости установите втягивающее устройство с зубцами каудально.
- Проверьте, подключен ли стерильный зонд ВЧД к датчику ВЧД. Промойте зонд ВЧД физиологическим раствором. Убедитесь, что в зонде ICP нет пузырьков воздуха.
- Надрежьте атлантозатылочную мембрану с помощью иглы 23 G. Сделайте отверстие для просадки щупа ICP через мембрану.
- Осторожно проведите зонд через атлантозатылочную мембрану. Слегка потяните за щуп и убедитесь, что он показывает пульсирующую кривую в диапазоне 0-5 мм рт.ст. Если нет, снимите щуп, проверьте подключение к датчику и подтвердите поток через просвет.
- Нанесите две капли тканевого клея. Сдвиньте силиконовую трубку диаметром 1 мм вперед к мембране и нанесите дополнительный клей, чтобы свести к минимуму риск смещения ИСП-зонда.
- Снимите втягивающие устройства.
- Сделайте один горизонтальный матрасный шов на головном конце разреза и один простой прерывистый шов на каудальный конец с помощью нерассасывающейся мононити 4-0 швов.
5. Размещение иглы и лазерно-доплеровского зонда
- Сделайте разрез по средней линии прямо перед глазами, на расстоянии 15 мм каудально.
- Удалите соединительную ткань и мышцы с помощью щипцов. Используйте конец стерильного ватного тампона в качестве ружина, что позволяет идентифицировать брегму и коронковые швы.
- Установите втягивающее устройство Alm.
- Поместите спинномозговую иглу 25 G в стереотаксическую рамку. Поместите иглу точно на брегму и отметьте положение.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите серединный сустав стереотаксической рамки под углом 30° к животному в вертикальной плоскости.
- Снимите иглу с брегмы, переместите рамку на 65 мм вперед, а затем установите иглу на место по средней линии, чтобы отметить место сверления.
- Сверлите до тех пор, пока твердая мозговая оболочка не будет определена ниже кости. Аккуратно удалите костные отломки с помощью прямых щипцов и заполните полость костным воском.
- Просверлите еще одно отверстие на 3-4 мм латерально справа от брегмы и прямо перед короночным швом для лазерного допплера. Не обязательно сверлить кость полностью. Будьте осторожны, чтобы не проникнуть в твердую мозговую оболочку.
- Ищите сосуды, в которых лазер-допплер может измерить кровоток. Установите лазер-допплер и проверьте значения. Требуется минимальное значение 100 FU. Снимите микроскоп (с искусственным освещением).
- Если значения все еще приемлемы, добавьте одну каплю клея для фиксации щупа.
- Перепроверьте, превышает ли значение 80 FU. Если значение ниже 80 FU, извлеките и переместите зонд так, чтобы достичь значения выше 80 FU.
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение, FU, является произвольной единицей, показывающей мозговой кровоток (CBF).
6. Индукция субарахноидального кровоизлияния (САК)
- Осторожно введите иглу через череп по средней линии между полушариями до тех пор, пока не почувствуется сопротивление основания черепа. Отведите иглу на 1 мм, чтобы обеспечить правильное расположение прямо перед хиазмой зрительного нерва.
- Поверните иглу на 90° по часовой стрелке так, чтобы кончик иглы был направлен вправо, чтобы обеспечить наиболее однородный результат при введении крови. Снимите стилет (Рисунок 1).
- Уравновесить в течение 15 мин и отрегулировать уровень анестезии до получения среднего артериального давления в пределах 80-100 мм рт.ст.
- Проведите анализ газов крови. Соответствующим образом отрегулируйте уровень анестезии.
- Извлеките 500 мкл крови из хвостового катетера с помощью шприца объемом 1 мл с тупой иглой 23 G.
- Заполните мертвое пространство камеры иглы позвоночника кровью, чтобы избежать впрыска воздуха. Извлеките иглу 23 G из наполненного кровью шприца и убедитесь, что шприц содержит 300 мкл крови.
- Подсоедините шприц к спинномозговой игле. Крепко схватите и введите кровь вручную, чтобы превзойти MAP.
- Наблюдайте за резким повышением ICP и резким падением CBF на ноутбуке.
ПРИМЕЧАНИЕ: CBF должен быть 50% или ниже по сравнению с исходным показателем в течение как минимум 5 минут, чтобы операция прошла успешно, см. Рисунок 2. Фиктивные крысы не проходят этапы 6.1-6.7, тем самым пропуская введение спинномозговой иглы в головной мозг, сводя к минимуму возможное спонтанное кровоизлияние и ятрогенное повреждение мозга.
