Измерение множественных митохондриальных параметров в нейронах с помощью проточной цитометрии

Аннотация

Источник: Liang, K. X., et al. Проточный цитометрический анализ множественных митохондриальных параметров в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках человека и их нервных и глиальных производных. J. Vis. Exp. (2021)

В этом видео демонстрируется мечение нейрональных клеток антителами к комплексам митохондриальной дыхательной цепи, белку, ассоциированному с митохондриальной ДНК, и белку внешней мембраны митохондриальной мембраны с последующей проточной цитометрией для количественной оценки их уровней.

Протокол

1. Измерение проточной цитометрии сложных субъединиц MRC (митохондриальной дыхательной цепи) и TFAM (митохондриального фактора транскрипции A) в фиксированных клетках

1. В конце периода культивирования отделите клетки (~10⁶) путем добавления реагента для диссоциации клеток; затем соберите клетки в пробирку объемом 15 мл. Промойте клетки центрифугированием фосфатным солевым буфером (PBS) (1x) дважды, центрифугируя при 300 × г в течение 5 минут.
2. Зафиксируйте клетки в 1,6% параформальдегиде (PFA) (1 мл 1,6% PFA в пробирке объемом 15 мл) при комнатной температуре (RT) в течение 10 мин. Промойте клетки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
3. Пермеабилизируйте клетки ледяным 90% метанолом (1 мл 90% метанола в пробирке объемом 15 мл) при температуре -20 °C в течение 20 минут.
4. Заблокируйте образцы в блокирующем буфере, содержащем 0,3 М глицина, 5% козьей сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) - фракция V в PBS (1x) (1 мл блокирующего буфера в пробирке объемом 15 мл). Промойте клетки центрифугированием с PBS (1x) дважды.
5. В течение 30 мин инкубируют клетки со следующими первичными антителами: анти-NDUFB10 (1:1000) для измерения субъединицы комплекса I, антисукцинатдегидрогеназного комплекса флавопротеина субъединицы А (SDHA, 1:1000) для измерения субъединицы комплекса II и анти-ЦОГ IV (1:1000) для измерения субъединицы комплекса IV, а также антитело против TFAM (митохондриального транскрипционного фактора А), конъюгированное с Alexa Fluor 488 (1:400). Окрашивание того же количества клеток отдельно анти-TOMM20 (транслоказой наружной митохондриальной мембраны 20) антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:400) в течение 30 мин (1 мл раствора первичного антитела в пробирке объемом 15 мл; подробнее об антителах см. в Таблице материалов).
6. Промойте клетки PBS (1x) один раз центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Добавьте вторичное антитело (1:400) в пробирки с NDUFB10, SDHA и COX IV и инкубируйте клетки с этими растворами в течение 30 мин.
7. Промойте клетки PBS (1x) один раз, центрифугируя при 300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя в пробирках примерно 100 μл. Ресуспендируйте клеточные гранулы в 300 мкл PBS (1x). Перенесите ячейки в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл, хранящиеся в темноте на льду.
8. Проанализируйте клетки на проточном цитометре (с конфигурацией 3 синих и 1 красным лазером). Обнаружение сигналов в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
анти-TFAM сопряжен с Alexa Fluor 488	Абкам	ab198308	Первичное антитело; использовать в соотношении 1:400, 2,5 мкл в 1000 мкл окрашивающего раствора; использовать мышиный моноклональный IgG2b Alexa Fluor® 488 в качестве контроля изотипа.
анти-TOMM20, сопряженный с Alexa Fluor 488	Санта-Крус Биотехнология	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Первичное антитело; использовать в соотношении 1:400, 2,5 мкл в 1000 мкл окрашивающего раствора; использовать мышиный моноклональный IgG2a Alexa Fluor® 488 в качестве контроля изотипа.
анти-NDUFB10	Абкам	ab196019	Первичное антитело; использовать в соотношении 1:1000, 1 мкл в 1000 мкл окрашивающего раствора; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикролик IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела; использовать моноклональный IgG кролика в качестве контроля изотипа.
анти-SDHA	Абкам	ab137040	Первичное антитело; использовать в соотношении 1:1000, 1 мкл в 1000 мкл окрашивающего раствора; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антикролик IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11008) в качестве вторичного антитела; использовать моноклональный IgG кролика в качестве контроля изотипа.
анти-ЦОГ IV	Абкам	ab14744, RRID:AB_301443	Первичное антитело; использовать в соотношении 1:1000, 1 мкл в 1000 мкл окрашивающего раствора; использовать Alexa Fluor ® 488 козий антимышиный IgG (1:400, Thermo Fisher Scientific, Каталог # A-11001) в качестве вторичного антитела; использовать мышиный моноклональный IgG в качестве контроля изотипа.
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Используется для этапов мойки
Формальдегид (PFA) 16%	Термо Фишер Научный	28908	Фиксация клеток
Глицин	Сигма-Олдрич	G8898	Используется в буфере блокировки
Бычья сыворотка альбумин	Европа Биопродукты	EQBAH62-1000	Блокатор для предотвращения неспецифического связывания антител в иммуноокрашивающих анализах и ингредиенте CDM