Пройдя Host-вирус Взаимодействие в Литические репликации Модель Herpesvirus

Summary

Мы описываем протокол определить ключевые роли принимающей сигнальных молекул в литическая репликация вируса герпеса модели, гамма-герпесвирусов 68 (γHV68). Использование генетически модифицированных мышей штамма эмбриональных фибробластов и для γHV68 литической репликации, протокол позволяет как фенотипическая характеристика и молекулярно допроса вирус-хозяин взаимодействий в вирусную литической репликации.

Abstract

В ответ на вирусную инфекцию хозяин развивает различные защитные реакции, такие как активация врожденных иммунных сигнальных путей, которые приводят к производству противовирусных цитокинов^1,2. Чтобы колонизировать хозяина, вирусы обязаны уклоняться от противовирусных реакций хозяина и манипулировать сигнальными путями. Разгадка взаимодействия хозяина и вируса прольет свет на разработку новых терапевтических стратегий против вирусной инфекции.

Мышиный γHV68 тесно связан с человеческим онкогенным герпесвирусом Капоши, ассоциированным с саркомой, и вирусом Эпстена-Барр^3,4. Инфекция γHV68 у лабораторных мышей предоставляет податливую модель мелких животных для изучения всего хода реакций хозяина и вирусной инфекции in vivo, которые недоступны для вирусов герпеса человека. В этом протоколе мы представляем панель методов фенотипической характеристики и молекулярного препарирования сигнальных компонентов хозяина в литической репликации γHV68 как in vivo, так и ex vivo. Наличие генетически модифицированных линий мышей позволяет исследовать роль сигнальных путей хозяина во время острой инфекции γHV68 in vivo. Кроме того, эмбриональные фибробласты (MEF) мыши, выделенные из этих дефицитных линий мышей, могут быть использованы для дальнейшего анализа ролей этих молекул во время литической репликации γHV68 ex vivo.

Используя вирусологические и молекулярно-биологические анализы, мы можем точно определить молекулярный механизм взаимодействия хозяина и вируса и идентифицировать гены хозяина и вируса, необходимые для литической репликации вируса. Наконец, бактериальная система искусственных хромосом (БАС) способствует введению мутаций в вирусный фактор (факторы), которые специфически прерывают взаимодействие хозяина и вируса. Рекомбинантный γHV68, несущий эти мутации, может быть использован для повторения фенотипов литической репликации γHV68 в MEF, испытывающих дефицит ключевых сигнальных компонентов хозяина. Этот протокол предлагает прекрасную стратегию для исследования взаимодействия хозяина и патогена на нескольких уровнях вмешательства in vivo и ex vivo.

Недавно мы обнаружили, что γHV68 узурпирует врожденный иммунный сигнальный путь, способствуя репликации вирусных литиков⁵. В частности, инфекция γHV68 de novo активирует иммунную киназу IKKβ, а активированный IKKβ фосфорилирует главный вирусный транскрипционный фактор, репликацию и трансактиватор (RTA), способствуя активации вирусной транскрипции. При этом γHV68 эффективно связывает свою транскрипционную активацию с активацией врожденного иммунитета хозяина, тем самым способствуя вирусной транскрипции и литической репликации. Это исследование представляет собой отличный пример, который может быть применен к другим вирусам для изучения взаимодействия хозяина и вируса.

Protocol

1. Мышь инфекции γHV68

1. Шесть-восемь недель старые, соответствующего пола однопометница мышей (8 до 12 мышей / группа) используются для вирусной инфекции. Разрешить мышей, чтобы акклиматизироваться в течение четырех суток (96 часов) после отгрузки.
2. Протокол шаги с помощью вируса должно осуществляться в кабинете биологической безопасности уровня 2 (BSL2) с использованием стандартных BSL2 меры предосторожности.
3. Подготовка вирусной суспензии (40 к 1 х 10 ⁵ бляшкообразующих единиц [PFU]) из γHV68 в 30 мкл стерильной PBS на мышь непосредственно перед экспериментом. Держите вирусной суспензии на льду.
4. Подготовка кетамин / ксилазина решение (1,5 мг кетамина и 0,15 мг xylazine/20 г веса тела, 100 мкл / мышь) для мыши седативный эффект. Убедитесь, что мышь была седативные, выполняя ноги шнура.
5. Sedate мышей с 1,5 мг кетамина и 0,15 мг ксилазина в 20 мг массы тела (100 мкл / мышь) внутри-перитонеального инъекции.
6. Доставка вирусной суспензии (30 мкл / мышь) интраназально, в капляхмода, в одну ноздрю из седативные мышей.
7. Положите мышь на одной стороне в течение 5 - 10 мин для облегчения дыхательных путей доставки вируса в легких.
8. Место мышей обратно в клетку и монитор мышей, пока они не полностью оправился от седации.
9. В разные дни после заражения, пожертвовать мышей CO ₂ удушья и урожай легких после смерти обеспечение / потеря глубокого сознания. Место легких в стерильном 1,5 мл с завинчивающейся крышкой пробирки, содержащие 500 мкл 1,0 мм циркония / Silica бисера. Хранить трубы на льду. Магазин образцы при -80 ° C, если не переходить к следующему шагу в тот же день. Селезенки или печени ткани могут быть собраны в это время для анализа вирусной задержки в зависимости от срока эксперимента.
10. Добавить 1 мл холодной бессывороточной DMEM в трубку и гомогенизации легкие борта избиения 30 секунд. Холод труб на льду в течение не менее 1 мин. Повторите эту процедуру один раз.
11. Центрифуга легких лизатов при 16000 RCF при 4 ° С в течение 1 мин и использовать supernatant, чтобы определить титр вируса от налета методом с использованием NIH3T3 или BHK21 монослоя (см. раздел 5 подробнее).

2. Определить γHV68 многоступенчатой ​​кинетики роста в мышиных эмбриональных фибробластов

1. Расти дикого типа мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ), и те недостатки в принимающей гена к югу от сливной (около 80%) плотностью до покрытия клеток.
2. Сплит MEFs в 24-луночный планшет на 10000 клеток / лунку по низкой multipilicity-о-инфекции (МВД) в день перед инфекцией. Эксперименты, как правило, осуществляется в трех повторах и в МВД от 0,001 - 0,05 обычно используется.
3. Подготовка γHV68 суспензии, содержащей необходимое количество вируса (0,5 мл на лунку).
4. Удалите среду и охватывает MEFs с 0,5 мл суспензии в γHV68 хорошо.
5. Инкубировать в культуре ткани инкубатора, рок каждые 30 минут, и позволит инкубации проводили в течение 2 часов.
6. Удалить вирусной суспензии, и покрывают клетки с 0,5 мл свежего сomplete DMEM среде, содержащей 8% эмбриональной телячьей сыворотки.
7. В разные дни после заражения, урожай среды и клеток в стерильные пробирки на 1,5 мл центрифуги. Сразу замораживания труб при температуре -80 ° C.
8. Выпуск γHV68 от MEFs путем замораживания при температуре -80 ° С, оттаивание в 37 ° С водяной бане и встряхивания. Три циклов замораживания и оттаивания, как правило, применяется к образцам.
9. Определить титр вируса от налета методом с использованием NIH3T3 или BHK21 монослоя (см. раздел 5 подробнее).
10. Прочитать титр вируса и земельный участок γHV68 многоступенчатой ​​кривой роста на MEFs.

3. Молекулярная рассечение γHV68 литической репликации в мышиных эмбриональных фибробластов

1. Выполните вирусной инфекции, как описано в шагах 2,1 до 2,6 раздела 2.
2. В разные дни после заражения, отбросить супернатант. Промойте клетки с холодным PBS и trypsinize клеток. Гранул клеток центрифуг в 1000 RCF при комнатной температуре в течение 1 мин. Удалите супернатант иМагазин клеток при -80 ° C.
3. Извлечение общей ДНК (хозяин и вирусного генома) и суммарной РНК в соответствии с ранее опубликованными методами ^5,6.
4. Выполните ПЦР в реальном времени с использованием совокупного ДНК и праймеров, специфичных для вирусных литического стенограммы, таких как RTA (ORF50), ORF57 и ORF60. Определить относительное количество внутриклеточных γHV68 генома со ссылкой на ген хозяин домашнего хозяйства (например, β-актин).
5. Для удаления геномной ДНК, лечение РНКазы ДНКазой имеет решающее значение для подготовки кДНК с общей РНК и олиго (дТ) _11-19 грунт. См. ссылку 5 для более подробной информации об извлечении, РНК, включая лечение РНКазы ДНКазой и RT-PCR. Выполните ПЦР в реальном времени с использованием кДНК и грунтовки, как указано выше, чтобы определить относительное количество вирусных стенограммы ссылку на этот принимающих гена домашнего хозяйства.

4. Создание рекомбинантной γHV68 с использованием бактериальных искусственных хромосом

Метог описанные здесь используется для введения мутаций в гене γHV68, которые участвуют в хост-вирус взаимодействия.

1. Подготовить фрагмент ДНК (около 1,5 КБ) последовательность дикого типа или последовательности проведения желаемой мутации в центральном регионе с помощью ПЦР.
2. Подготовка бактериальные искусственные хромосомы (BAC), который содержит вставки транспозона ⁷ вокруг мутации сайт, который специально инактивирует ген интересующего гена, по миди-шкалу очистки (OriGene). Магазин алкоголя в крови ДНК при температуре 4 ° C (во избежание замораживания / оттаивания BAC ДНК).
3. BAC трансфекции ДНК и ПЦР продукт, содержащий желаемый мутации гена интереса в клетках (например, NIH3T3 или BHK21), которые отличаются высокой разрешительной к γHV68 литической репликации, с Lipofectamine 2000 (Invitrogen).
4. Держите разбиение ячеек до цитопатического эффекта (CPE) появляется в монослое. Сбор, содержащих вирус супернатант и, при необходимости, усилить вируса в NIH3T3 или BHK21 клеток.
5. Infect NIH3T3 клетокрекомбинантный вирус путем центрифугирования при 1800 оборотов в минуту, 30 ° С в течение 30 мин.
6. Урожай γHV68-инфицированных NIH3T3 клетки и подготовить circularized вирусного генома использованием протокола Hirt в ^8,9.
7. Преобразование Electro-MAX DH10B компетентных клеток (Invitrogen) путем электропорации и экран для колоний, которые являются устойчивость к хлорамфеникол (см), но чувствительны к канамицин (Кан) (Cm-ген устойчивости в основу BAC, в то время как Кан-ген устойчивости в транспозона вставку).
8. Рост колоний Cm ^{R S} Кан в среде, содержащей chlorophenicol и подготовить BAC ДНК с мини-или миди-шкалу очистки (OriGene).
9. Проверка нужную мутацию в гене-мишени с помощью ПЦР, используя праймеры, специфичные для флангового регионов мутации сайте, и секвенирования.
10. Подтвердите не хромосомных перестроек в BAC путем переваривания выбранных ферментов рестрикции и пульс поле гель-электрофореза.
11. Трансфекции рекомбинантной BAC в NIH 3T3 или BHK21 клеток с Lipofectamine2000 (Invitrogen) для подготовки рекомбинантного γHV68.
12. Держите пассажей клеток до CPE проявляется в монослой. Сбор, содержащих вирус супернатант и усиливают рекомбинантного γHV68 в NIH3T3 или BHK21 клеток.
13. Определить титр рекомбинантных вирусов и вирусных характеризуют рост свойствами бывших естественных условиях и в естественных условиях, как описано в разделах 1 и 2.

5. Определить титр вируса от бляшек

1. Расти NIH3T3 клетки к югу от сливной (около 80%) плотностью до покрытия клеток.
2. Сплит NIH3T3 в 24-луночный планшет на 20000 клеток / лунку в день перед инфекцией.
3. Подготовка 10-кратный серийно разбавленных супернатанты вируса с DMEM среде, содержащей 8% новорожденных телячьей сыворотки (NCS).
4. Удалите среду и охватывает NIH3T3 клеток с 0,5 мл γHV68 подвески.
5. Инкубировать в культуре ткани инкубатора, рок каждые 30 минут, и позволит приступить инкубациив течение 2 часов.
6. Удалить вирусной суспензии и крышку клетки с 0,5 мл DMEM среде, содержащей 2% NCS и 0,75% метилцеллюлозы (Sigma).
7. Инкубировать в культуре ткани инкубатора. Граф бляшек на 6-й день после заражения. Окрашивание монослоя, например, с фиолетовым кристаллом, может способствовать доска счета.
8. Рассчитать титр вируса в неразбавленном лизатов тканей или клеточных лизатов с помощью следующей формуле: Титр (PFU / мл) = D х N х 1000 мкл / мл ÷ V мкл. N, среднее количество налета на соответствующее разведение, D, разведение раза (например, 5, 10, 100 .....) V (мкл), объем серийно разбавленного супернатанта добавил на лунку.

6. Представитель Результаты:

Три представителя цифры показанные здесь, в том числе γHV68 литической репликации в легких дикого типа и Mavs ^{- / -} мыши ^10, γHV68 литического фенотипов репликации в мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) и рекомбинацииМуравей γHV68, несущих мутации в сайтах фосфорилирования, что модулируются MAVS-зависимых IKKβ. Эти три подтверждающих экспериментов представляет собой схему для определения роли врожденного иммунитета компонентов в γHV68 литической репликации в естественных условиях и бывших естественных условиях.

Рисунок 1 γHV68 нагрузки в легких Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{-. / -} Мышей. А) два основных врожденных сигнальные пути вниз по течению от MAVS. MAVS адаптер молекулы реле сигнализации от цитозольной RIG-I-подобными рецепторами для активации NFκB и интерферон регуляторных факторов (ИСО), которая, в свою очередь, до-регулирующие экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферонов. B) Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} мыши были заражены с 40 PFU γHV68 интраназально и вирусной нагрузки в легких по указанной моменты времени были сдерживать деляется бляшек использованием NIH3T3 монослоя. Каждый символ представляет собой мышь.

Рисунок 2. ΓHV68 литического кинетики репликации в эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ). Литической репликации γHV68 на Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} MEFs оценивали по многоступенчатой ​​кривые роста (A) и количественный ПЦР в реальном времени (B). Для обоих экспериментах, равное количество MEFs и количество γHV68 были использованы для вирусной инфекции при множественности-о-инфекции (МВД) 0,01. (А) Клетки и супернатанты собирают в указанных точках времени и в зависимости от бляшек, чтобы определить вирусные титры. (B) Тотальная РНК была извлечена из γHV68-инфицированных MEFs и проанализированы количественные ПЦР в реальном времени с праймерами, специфичными для отдельных литического транскриптов (RTA, ORF57, и ORF60).

ig3.jpg "/>
Рисунок 3. Литическая кинетика репликации рекомбинантного γHV68, несущих мутации в домене трансактивации RTA, которые отменяют фосфорилирования IKKγ. (A) Многоступенчатая кривые роста рекомбинантным вирусом дикого типа (γHV68.wt) и вирус-мутант (γHV68.mut) в Mavs ^{+ / +} и Mavs ^{- / -} MEFs клеток (MOI = 0,01). MEFs были инфицированы γHV68 в МВД 0,01. Клетки и супернатанты собирают в указанных точках времени и вирусные титры были определены бляшек использованием NIH 3T3 монослоя. (B) γHV68 RTA уровне мРНК в γHV68-инфицированных NIH3T3 клеток (MOI = 0,01). В 30 ч после заражения, общей РНК была извлечена из γHV68-инфицированных NIH 3T3 клетки и проанализированы количественные ПЦР в реальном времени.

Discussion

В ответ на вирусную инфекцию, MAVS зависит от врожденной иммунной сигнальных путей, которые активируются, чтобы содействовать производству антивирусных цитокинов ^10-14. Использование мышиный γHV68 в качестве модели вируса саркомы связанных вирус герпеса человека онкогенных Капоши и вирус Эпштейна-Барр ^3,4, мы обнаружили, что γHV68 узурпирует MAVS-IKKβ пути к содействию вирусной репликации литического через активацию транскрипции ^5. Применение генетически модифицированных MEFs и методы в ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге
Липофектамина 2000	Invitrogen	11668-019
Электро-MAX DH10B компетентных клеток	Invitrogen	18290-015
Метилцеллюлоза	Сигма	M0512
POWERPREP HP плазмиды системы Miniprep	OriGene	NP100004
POWERPREP HP плазмиды системы Midiprep	OriGene	NP100006