Все процедуры, связанные со сбором образцов, были выполнены в соответствии с рекомендациями института IRB.
1. Измерение репортерных сигналов люциферазы, которые соответствуют расщеплению γ-секретазы APP-C99 ( белок-предшественник амилоида - С-концевой 99-аминокислотный фрагмент)
ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, обратитесь к предыдущим публикациям для подробного описания генерации клеток CG (C99-Gal4).
- Засейте CG-клетки (20 000 клеток/лунку) на 96-луночные микропланшеты в конечном объеме 200 μл/лунку в питательной среде, которая состоит из модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) плюс 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 5 μг/мл бластицидина, 250 μг/мл антибиотика (e.g., цеоцина), и 200 мкг/мл гигромицина В.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.
- Перенесите микропланшеты в увлажненный инкубатор с CO2 и инкубируйте при температуре 37 °C в течение ночи.
- Удалите по 100 мкл питательной среды из каждой лунки.
- Добавьте 100 μл/лунку питательной среды, содержащей 2 μг/мл тетрациклина с 0,2% диметилсульфоксидом (ДМСО), 2 μM CL-387,785, 2 μM N-[N-(3,5-дифторфенацетил-L-аланил)]-S-фенилглицина t-бутиловым эфиром (DAPT) или другими связанными ингибиторами ErbB1/ErbB2.
- Инкубируйте обработанные клетки КГ в микропланшетах при 37 °C в течение 24 ч.
- Удалите 150 μл/лунку питательную среду из микропланшетов.
- Добавьте реагент для анализа люциферазы 50 μл/лунку (см. Таблица материалов).
- Перенесите микропланшеты в люминесцентный считыватель микропланшетов.
- Выдержите микропланшеты при комнатной температуре в течение 5 минут, осторожно перемешивая.
- Определите люциферазу, излучаемую Firefly, используя предварительно определенную программу, хранящуюся в считывателе микропланшетов люминесценции.
