Иммуногистохимия для идентификации области locus coeruleus в срезах мозга мыши

Аннотация

Источник: Schmidt, K. et al., Локализация locus coeruleus в мозге мыши. J. Vis. Exp. (2019)

В этом протоколе описывается использование иммуногистохимии для идентификации областей locus coeruleus в срезах мозга мыши. Нацеливаясь на дофамин β гидроксилазу с помощью антител, меченных зелеными флуорофорами, нейроны, продуцирующие норадреналин, визуализируются под микроскопом как зеленая флуоресценция.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.

1. Срез мозга

1. Для иммобилизации и обезболивания мышей применяют 3% изофлуран.
   1. Смочите ватный тампон каплями изофлурана и поместите его в микроцентрифужную пробирку объемом 15 мл. Поместите нос животного в трубку и дайте ему вдохнуть изофлуран. Проверяют глубину анестезии по отсутствию реакции на защемление пальца ноги.
2. Положите животное на спину и обездвижьте его, прижав его конечности Т-образным штифтом, имея при этом доступ к животу.
3. Разрежьте животное хирургическими ножницами, разрезая кожу живота и разрезая кожу в области грудной клетки. Прикрепите кожу с помощью Т-образных штифтов. Затем разорвите перитонеальную оболочку до грудной клетки. Обнажить сердце, размяв грудную полость и разрезав диафрагму.
4. Разрежьте правое предсердие, чтобы кровь могла вытекать из животного. Введите шприц объемом 10 мл с иглой 25 калибра в левый желудочек и проведите перфузию 10 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволяет раствору протекать через системный кровоток и выходить через правое предсердие.
5. Извлеките шприц объемом 10 мл и вставьте иглу 25 калибра, прикрепленную к шприцу объемом 60 мл. Перфузируют через левый желудочек 50 мл ледяного 4% параформальдегида (PFA).
   1. Приготовьте ледяной 4% раствор PFA, разбавив 10% раствор PFA в H₂O и охладив окончательный 4% раствор PFA до 4 °C.
6. Изолируйте голову мыши и удалите мозг из черепа.
   1. Срежьте кожу с шеи, а затем разрежьте по направлению к глазам, чтобы обнажить череп. Трескайте череп от шеи до носа, а затем от одного глазного яблока до другого. Очистите череп и вырежьте весь мозг.
7. Инкубируйте мозг в 4% PFA в течение 24 ч при 4 °C.
8. Перенесите мозг с помощью щипцов в коническую трубку объемом 50 мл, заполненную 25 мл 30% раствора сахарозы. Держите его при температуре 4 °C в течение 48-72 часов, пока мозг не опустится на дно трубки.
9. Разрежьте мозг взрослой мышью с помощью матрицы слайсера коронального сечения через средний мозг (~3 мм позади брегмы). Оставьте участок мозга, содержащий ствол мозга.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это приведет к образованию двух участков мозга - один содержит большую часть коры головного мозга (спереди разреза) и другой содержит ствол мозга/мозжечок (сзади разреза). Используйте раздел ствола мозга для выполнения следующих шагов.
10. Заложите секцию ствола мозга так, чтобы поверхность разреза была помещена на дно закладной формы, окруженной составом с оптимальной температурой резки (OCT); переместите встроенный мозг в морозильную камеру при температуре -80 °C и заморозьте не менее чем на 12 часов – до дальнейшего использования.
11. Резка на криостате: поместите в криостат форму, содержащую мозг в ОКТ; Инкубируйте его в криостате в течение нескольких часов, чтобы отрегулировать температуру мозгового блока до температуры криостата.
12. Снимите форму, чтобы обнажить ОКТ-блок, содержащий мозг.
13. Используйте бритвенные лезвия, чтобы удалить излишки ОКТ с поверхности блока, не затрагивая мозг.
14. Установите блок ОКТ на патрон криостата, обнажив поверхность разреза мозга по направлению вперед.
15. Отрегулируйте поверхность разреза мозга так, чтобы она была ориентирована параллельно бритвенным лезвиям криостата.
16. Обрежьте мозг, начиная с мозгового вещества, разрезая участки 100 мкм рострально.
17. Обрезайте рострально до тех пор, пока мозжечок и ствол мозга не будут разрезаны как один непрерывный срез. Начните сбор ломтиков толщиной 50 μм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При ростральном отрезании от продолговатого мозга, ствол мозга и мозжечок будут разделены на две отдельные части. В ростральных отделах ствол мозга и мозжечок со временем сольются на уровне 4-го желудочка. Как только боковые края 4-го желудочка будут хорошо сформированы, мозжечок и ствол мозга выйдут как один непрерывный срез.
    1. Соберите окруженный ОКТ срез мозга с помощью щипцов и поместите его в лунку 24-луночной пластины, заполненной PBS (Рисунок 1a). Locus coeruleus (LC) будет наиболее заметным, когда мозжечок и нижний колликулус встретятся друг с другом на расстоянии ~-5,52 мм позади брегмы (Рисунок 2b).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Самая передняя часть ЛК исчезнет, как только мозжечок будет полностью рассечен, и больше не будет окружать нижний колликулус на ~-5,34 мм позади брегмы (Рисунок 2c).

2. Иммуногистохимия дофамина β-гидроксилазы (DBH) или тирозингидроксилазы (TH) (рис. 1)

1. День 1
   1. Выбранные ломтики промыть три раза в течение 5 мин в PBS.
   2. Пермеабилизировать в течение 24 ч в 0,5% фосфатно-солевом буфере с моющим средством (PBSD) при температуре 4 °C.
      1. Развести 125 мкл моющего средства в 25 мл PBS.
2. День 2
   1. Промойте ломтики три раза в течение 5 минут в 0,5% PBSD.
   2. Добавьте первичное антитело, анти-DBH или анти-TH, в течение 18 ч при разведении 1:500 в 0,5% PBSD при 4 °C.
3. День 3
   1. Промойте ломтики три раза в течение 10 минут в 0,5% PBSD.
   2. Добавьте желаемое вторичное антитело (488 donkey anti-rabbit для зеленой флуоресценции) в разведении 1:1000 в 0,5% PBSD в течение 16 ч.
   3. Оберните 24-луночный планшет алюминием и поместите при температуре 4 °C.
   4. Промойте ломтики три раза в течение 5 минут в 0,5% PBSD.
   5. Стирать в течение 5 минут в PBS.
   6. Переложите срезы с помощью кисточки для карандаша в емкость с водой.
   7. Устанавливайте плавающие в воде слайсы на заряженные горки.
   8. Секции покровного стекла с жестко установленным монтажным материалом Допаминбета-гидроксилаза
   9. Высушите смонтированные участки мозга в течение 30 минут при комнатной температуре.
   10. Изображение срезов мозга на конфокальном или флуоресцентном микроскопе с настройками для обнаружения сигналов от соответствующей длины волны флуорофора вторичного антитела.
   11. Настройте микроскоп в фокальную плоскость среза мозга и сделайте одно изображение с 10-кратным увеличением.

Результаты

Рисунок 1: Обнаружение ЛК путем иммуноокрашивания срезов мозга на DBH или TH. (a) Один мозг мыши был разрезан на 50 мкм срезы вокруг ствола мозга и собран в двух 24-луночных чашках. Каждый 5-8-й собранный срез мозга был закреплен на пленочной крышке для визуализации с помощью XFM. Эти срезы помечены синими цифрами между лунками. Соседние срезы, плавающие в PBS, были иммуноокрашены для DBH для обнару...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Матрица для слайсера мозга взрослой мыши	Инструменты Zivic	BSMAS001-1
Вторичное антитело против кролика, Alexa Fluor 488 (источник - осел)	Термо Фишер Научный	А-21206
Заряженные стеклянные слайды	Genesee	29-107
Конфокальный микроскоп	Zeiss	LSM 800
Криостат	Microm GmbH	HM 505E
Лезвия для резки Cryostat	Thermo Fisher Scientific	MX35
Ножницы мини, 9,5 см	Antech Diagnostcs	503241
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол)	Сигма-Олдрич	Д9542-10МГ
Антитела к допамин β гидроксилазе (DBH) - собственное производство (источник - кролик)	B. Эйппер	-
Антитела к допамин β гидроксилазе (DBH) - коммерчески доступны (источник - кролик)	Клеточная сигнализация	8586
Соколиные тубы, 50мл	США Научный	339652
Форан (изофторан)	Бакстер	НДЦ 1019-360-60
Щипцы Micro Adson	Antech Diagnostcs	501245
Твердо установленный монтажный носитель	Электромагнитные науки	17984-24
Микроскоп	Паскаль	LSM 5
Многолуночные планшеты, 24 лунки	Термо Фишер Научный	930186
Оптимальная температура резания (OCT)	VWR / тканевая техника	102094-106
Параформальдегид (PFA)/формалин 10%	Научный Фишер	SF98-4
Одноразовые формы для встраивания Peel-A-Way	Polysciences Inc.	18646A
Кисть для карандаша
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Технологии жизни	14190250
Бритвенные лезвия	Амазонка	ASIN: B000CMFJZ2
Шпатели	Antech Diagnostcs	14374
T контактов	Офисное депо	344615
Мозг мыши в стереотаксических координатах, Паксинос и Франклин, 3-е издание	Амазонка	ISBN: 978-0123694607
Тритон-Х 100 (для приготовления PBSD)	Сигма-Олдрич	Т8787
Tween 20	Сигма-Олдрич	P7949-500ml
Антитела к тирозингидроксилазе (ТГ) (источник - кролик)	EMD Millipore	АВ152
Широкоугольный флуоресцентный микроскоп	Zeiss	Axio Zoom.V16