Способ нанесения закрытой черепно-мозговой травмы головного мозга у дрозофил

Аннотация

Источник: Katzenberger, R. J., et al., Метод нанесения закрытой черепно-мозговой травмы у Drosophila. J. Vis. Exp. (2015).

В видео демонстрируется использование устройства для лечения травмы высокого напряжения (HIT) для индуцирования закрытой черепно-мозговой травмы (ЧМТ) у Drosophila. ЧМТ вызывает механическую травму головного мозга, влияющую на функцию нейронов, что со временем приводит к нейродегенерации и смертности.

Протокол

1. Построение устройства HIT

1. Прикрепите пружину к плате с помощью двух зажимов и четырех винтов (Рисунок 1A). Центрируйте зажимы относительно ширины доски и прижмите их друг к другу внешним зажимом заподлицо с краем доски. Перед тем как прикрепить хомуты, согните их плоскогубцами, чтобы они плотно прилегали к пружине.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Таблица 1 для описания материалов, необходимых для создания устройства HIT. Зажатый конец пружины должен находиться на расстоянии 1/8 дюйма (3,2 мм) от края доски, а свободный конец должен выступать над доской на 3/4 дюйма (19 мм). Отрегулируйте пружину так, чтобы она лежала параллельно длине доски.
2. Один раз оберните свободный конец пружины клейкой полоской из Velcro петель. Внешний край Velcro должен быть заподлицо с концом пружины. Velcro важна, потому что она используется для крепления флакона к пружине путем создания плотного компрессионного фитинга. Velcro также позволяет легко подключать и снимать флаконы, что позволяет обрабатывать множество флаконов за короткий промежуток времени.
3. Поставьте крышку ведра со льдом вверх дном, по центру, плотно прилегая к деревянной доске. Расположите приподнятую область крышки ведра для льда так, чтобы длинная кромка была параллельна ширине доски. Обратите внимание, что приподнятая область ведра со льдом находится на 1/2 дюйма (13 мм) выше, чем деревянная доска, так что при прикреплении флакона к пружине пружина не будет лежать ровно на доске.
4. Придвиньте все устройство к неподвижному объекту, например к стене, так, чтобы крышка ведра со льдом была зажата между доской и объектом и не двигалась.
5. Прикрепите бумажный транспортир к дну картонного лотка для флаконов с мухами и поставьте его краем по длине картона так, чтобы отметка 90° совпала с пружиной, когда она возвращается в идеально вертикальное положение.

2. Работа устройства HIT

1. Поместите от 1 до 60 мушек под наркозом CO₂ в пустой флакон и закройте флакон плотно прилегающим ватным тампоном.
2. Ограничьте мухи на дне 1 дюйма (2,5 см) флакона, проталкивая ватный тампон в флакон до тех пор, пока он не окажется на расстоянии 1 дюйма (2,5 см) от дна. Полезно провести линию на флаконе на отметке 1 дюйм (2,5 см). Обратите внимание, что ограничение мух большими или меньшими областями флакона может повлиять на тяжесть фенотипов.
3. Подождите 5 минут, пока мухи восстановятся подвижными от CO₂. Обратите внимание, что неизвестно, достаточно ли 5 минут для полного устранения эффектов CO₂.
4. Вставьте конец пружины в флакон до тех пор, пока внутренний край Velcro не окажется на одном уровне с верхом флакона (Рисунок 1B). Когда пружина лежит ровно, 1 дюйм (2,5 см) флакона должен перекрывать приподнятую область крышки ведра со льдом. Флаконы можно использовать многократно.
5. Сидя, держите флакон в области Velcro большим и указательным пальцами левой руки. Крепко прижмите доску к столешнице правой рукой. В качестве альтернативы используйте С-образные зажимы, чтобы плотно прижать доску к столешнице.
6. Потяните пружину идеально ровно обратно на нужный угол. Отпустите пружину. Дайте пружине полностью остановиться.
7. Снимите флакон с пружины и дайте мухам восстановиться в течение ≥5 минут. Подвергните мух еще одному удару или переложите мух в пузырек с кормом для мух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Различные анализы могут быть использованы для оценки фенотипических эффектов ударов от устройства HIT. Например, влияние на продолжительность жизни может быть определено путем анализа процента мух, которые иногда выживают после травмы, влияние на морфологию мозга может быть определено с помощью гистологического анализа головы, а влияние на экспрессию генов может быть определено путем количественного анализа уровней мРНК.
8. Определить эффекты процедуры, которые не обусловлены ударами, путем идентичной обработки контрольных мух, которые не подвергались ударам. Надевайте средства защиты органов слуха, так как при ударе флакона о крышку ведра со льдом издается громкий шум.

Результаты

Рисунок 1: Схема устройства HIT. (A) Иллюстрация вида сверху на прибор HIT в положении покоя. (B) Иллюстрация вида сбоку прибора HIT. Пружина отображается в неподвижном положении (темно-красный) и отклонена на 90° (светло-красный).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Оцинкованная пружина сжатия	Группа Хиллмана	540189	9 7/8 дюйма (длина), 15/16 дюйма (внешний диаметр), 0,12 дюйма (размер проволоки)
Деревянная доска			9 дюймов (длина), 6.5 дюймов (ширина), 0.75 дюймов (высота)
Зажимы	Сигма Электрик Мануфэкчуринг Корпорейшн Корпорейшн	49822	3,10 дюйма (длина), 0,68 дюйма (ширина), 1,11 дюйма (высота), ремни EMT с двумя отверстиями, нажмите на тип для 1-дюймового стального кабелепровода EMT
Петля половинки самоклеящейся липучки			3 дюйма (длина), (3/4 ширины)
Полиуретановая крышка ведра для льда	Научный Фишер	02-591-45	9 1/8 дюйма (длина), 9 1/8 дюйма (ширина), 1 1/4 дюйма (высота)
Пластиковые флаконы для мух	Прикладная наука	АС-510	3 11/16 дюйма (высота), 1 1/16 дюйма (внутренний диаметр), 1 1/8 дюйма (внешний диаметр)
Большие ватные шарики	Научный Фишер	22-456-883
Транспортир для бумаги			10 в (диаметр)