Вирусно-опосредованное мечение и трансплантация медиальных ганглионарных клеток выдающегося состояния для исследований in vivo

Аннотация

Источник: Фогт, Д. et al., Вирусно-опосредованное мечение и трансплантация клеток медиального ганглионарного величия (MGE) для исследований in vivo. J. vis. exp. (2015).

В этом видео демонстрируется вирусная маркировка и трансплантация клеток медиального ганглионарного возвышения (MGE) для исследований in vivo. В нем описаны этапы, связанные с трансдуцированием клеток MGE с вирусным репортером, трансплантацией этих трансдуцированных клеток в кору головного мозга детеныша мыши и обеспечением экспрессии репортеров в определенных подтипах интернейронов.

Протокол

Все процедуры с участием животных были рассмотрены местным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.

1. Подготовка к лентивирусу (необязательный шаг)

1. Разделите три 10-сантиметровые пластины HEK293T клеток для каждого лентивируса, которые должны быть изготовлены в присутствии 10 мл DMEM/10% FBS и вырастите до ~60-70% слияния. Выращивайте клетки в инкубаторе при температуре 37 °C с 5%_CO2.
2. Трансфектируйте следующие ДНК-плазмиды (всего 10 мкг) в каждую пластину с использованием любого реагента для трансфекции: 6,4 мкг лентивирусного вектора CAG-Flex-GFP, 1,2 мкг pMD2.G (кодирует VSV-g), 1,2 мкг pRSV-Rev и 1,2 мкг pMDLg/pRRE. Три лентивирусных упаковочных вектора коммерчески доступны.
   заметка: В этом подходе используются лентивирусные векторы 3-го поколения, но также будут работать векторы 2-го поколения и связанные с ними плазмиды.
3. Подготовьте контейнер для отходов, содержащий 10% раствор отбеливателя, в вытяжке, сертифицированной по стандарту BSL2, чтобы обезвредить любые растворы или устройства, которые контактировали с лентивирусом или содержали его. Далее полностью удалите среду через 4-6 часов после трансфекции в раствор отбеливателя, замените на такой же объем новую среду и дайте клеткам вырасти.
4. Через 4 дня соберите среду в конические пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при давлении 1000 x g в течение 15 минут, чтобы измельчить любой мусор клеток. Далее отфильтруйте надосадочную жидкость через мембрану толщиной 0,45 мкм. Любой фильтр с низким связыванием белка, такой как PVDF, работает хорошо. осторожность: Поместите в раствор отбеливателя как твердые, так и жидкие вирусные отходы.
5. Загрузите 30 мл отфильтрованной надосадочной жидкости в ультрацентрифужные пробирки и в ультрацентрифугу. Центрифугируйте при 100 000 x g в течение 2,5 часов при 4 °C. Откройте пробирки центрифуги в колпаке BSL2 и удалите надосадочную жидкость до 10% отбеливателя. Добавьте в гранулу ~100 μл PBS, что дает титры от 1x10⁷ до 1x10⁸ инфекционных единиц/мл. Аликвоты на следующий день и хранить при температуре -80 ºC. Аликвоты лентивируса стабильны при -80 °C в течение как минимум шести месяцев.
6. Важное соображение: многие учреждения сейчас имеют вирусные ядра. Приобретайте концентрированный вирус с минимальным титром 1x10⁷ инфекционных единиц/мл для достижения оптимальных результатов.

2. Мыши-доноры для вскрытия MGE

1. Во-первых, настройте временное скрещивание между представляющей интерес Cre-экспрессирующей линией и либо мышью дикого типа (WT), либо мышью, которая будет экспрессировать репортера после Cre-опосредованной рекомбинации.
   заметка: Многие линии Cre-driver являются трансгенными и поддерживаются и разводятся в гемизиготном состоянии. Таким образом, только половина эмбрионов будет содержать трансген Cre. ДНК может быть быстро подготовлена из эмбрионов для короткой ПЦР для выявления аллеля Cre. Затем эмбрионы Cre⁺ могут быть собраны таким образом, чтобы была использована только ткань MGE желаемого генотипа. В качестве альтернативы, для отбора эмбрионов для вскрытия и трансплантации методом MGE может быть использован Cre-зависимый репортер.
2. Рассчитайте, какой день будет соответствовать Е13.5. Если животные были спарены накануне вечером, то день вилки равен 0,5. Закажите мышей с временной беременностью или самку WT с детенышами P1, чтобы иметь постнатальных (P)1 мышей в день, когда донорская ткань будет E13.5. В качестве альтернативы, организуйте эти вязки в домашних условиях за неделю до спаривания животных-доноров.
   заметка: Прежнюю стратегию генерации эмбрионов/детенышей E13.5 и P1 в один и тот же день часто трудно надежно реализовать.

3. Подготовка сред, инструментов и оборудования.

1. Подготовьте реагенты и инструменты для подготовки клеток MGE (табл. 1).
   1. Подготовьте чистую поверхность и поместите на поверхность чистые щипцы, ножницы и либо микрохирургический нож, либо тонкие щипцы (для точного рассечения тканей).
   2. Приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) для препарирования и модифицированную орлиную среду Дульбеко (DMEM) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) для трансдукции.
   3. Предварительно инкубируйте 20-30 мл DMEM/10% FBS в инкубаторе для культуры тканей при температуре 37 °C в течение примерно 1 часа. Крышка должна быть ослаблена, чтобы обеспечить газообмен и выравнивание pH среды.
      заметка: Предварительная инкубация среды может быть подготовлена непосредственно перед началом вскрытия.

4. Подготовка клеток MGE

1. Принесите в жертву беременную мышь в соответствии с утвержденным протоколом для животных и поместите эмбрионы в чашку Петри диаметром 10 см с ледяным HBSS.
2. Удалите мозг у каждого эмбриона с помощью препарирующего эндоскопа (делайте по одному, оставляя остальные эмбрионы в ледяном HBSS), а затем приступайте к вырезанию ткани MGE><. заметка: Ниже и на рисунке 1 приведены основные шаги, показывающие, как удалить MGE.
   1. Расположите мозг вентральной стороной вверх (рисунки 1А, А'). Примечание: также допустимо, чтобы спинная сторона была обращена вверх. Разрежьте мозг пополам по сагиттальной плоскости, чтобы получить две части. Показан пример полусектированного мозга (рисунки 1B, B'); Обратите внимание, что дорсальная (вышележащая кора) и вентральная части мозга покрывают и окружают ткань ганглионарного возвышения (GE).
   2. Затем доминирующей рукой держите либо очень тонкие щипцы, либо колющий нож (Таблица 1), обездвиживая полушарие щипцами, удерживаемыми недоминирующей рукой. (Медиальная сторона полушария должна быть обращена вверх). Разверните дорсальную и вентральную ткань с помощью щипцов и ножа, чтобы выявить подлежащую ткань GE (Рисунок 1C и диаграмма на рисунке 1C').
      заметка: Удаление некоторых сред из чашки Петри для рассечения может облегчить стабилизацию ткани во время выполнения диссекции MGE.
   3. Сделайте прямые надрезы с помощью ножа для ножа или тонких щипцов, чтобы отделить ткани CGE, LGE и перегородки (см. примеры надрезов, обозначенных красными пунктирными линиями, рисунки 1D и D'). Эти надрезы можно делать в любом порядке.
      заметка: Представьте себе MGE как «коробку», которая вырезается из окружающих тканей. Это помогает воспроизводимо делать одинаковые разрезы для каждого рассечения, тем самым уменьшая вариабельность при рассечении тканей.
   4. Наконец, переверните MGE на бок и обрежьте нижнюю часть (то, что было латеральной стороной мозга). Это удаляет мантийную зону MGE (отбросьте на рисунках 1E и 1E') из остальной части MGE. Остальная часть MGE в основном содержит желудочковую зону и части субвентрикулярной зоны MGE, которые содержат почти все клетки-предшественники MGE. Приступайте к этой салфетке.
3. Важное соображение: Добавление силиконового геля на дно чашки Петри может служить отличной поверхностью для препарирования, поскольку оно защищает нежные кончики щипцов и обеспечивает мягкую поверхность для скрепления ткани щипцами.

5. Мечение и трансплантация лентивирусов

1. Переместите пробирки с салфеткой MGE в колпак, сертифицированный BSL2, и удалите среду.
   заметка: Ткань MGE достаточно большая, чтобы быть видимой, и оседает на дно трубки, позволяя легко и бережно удалять холодную среду.
2. Добавьте ~500 мкл среды DMEM/10% FBS, которая была предварительно инкубирована в инкубаторе для тканевых культур при температуре 37 °C. Затем добавьте полибрен для облегчения трансдукции в каждую пробирку в конечной концентрации 8 мкг/мл. Измельчите ткань MGE для создания одноклеточной суспензии с помощью наконечника пипетки P1000. Наконец, добавьте ~15-20 μл концентрированного лентивируса в каждую пробирку.
3. Важное соображение: 10-12 растираний достаточно, чтобы разрушить ткань MGE из одного эмбриона, но может потребоваться больше растираний, если несколько MGE объединены вместе. Попробуйте различные условия растирания, чтобы определить, какой из них работает лучше всего.
4. Надежно закройте каждую пробирку, переверните для смешивания, затем поместите все пробирки в инкубатор с температурой 37 °C. Инкубируйте клетки в лентивирусе в течение не менее 30 минут и до 1 часа, более длительное время приводит к снижению жизнеспособности клеток. Переворачивайте трубки каждые 10 минут, пока не истечет время.
5. После инкубации лентивирусом извлеките пробирки из инкубатора и центрифугируйте при ~700 x g в течение 3 мин для гранулирования клеток. В капюшоне BSL2 удалите надосадочную жидкость и уменьшите до 10% отбеливателя. Затем добавьте 1 мл DMEM/10% FBS и растирайте гранулу 2-3 раза, чтобы промыть, затем снова центрифугируйте с той же скоростью, чтобы гранулировать клетки. Повторите этот шаг промывки еще 2-3 раза, чтобы удалить излишки вируса.
   заметка: Выполните этапы центрифугирования при температуре 4 °C; Тем не менее, снижение жизнеспособности не наблюдалось при выполнении коротких вращений в RT.
6. После окончательной промывки удалите как можно больше среды и положите каждую трубку на лед. Из-за остаточной среды по бокам пробирки ~2-3 мкл среды в конечном итоге покроют клеточную гранулу к моменту начала процедуры трансплантации.

6. Трансплантация и валидация

1. Приобретите щенков хозяина P1 и подготовьте область процедуры, распылив на нее 70% этанола. Для поддержания стерильности во время процедуры рекомендуется проводить эти процедуры в специальном чистом процедурном кабинете. Кроме того, используйте автоклавные хирургические инструменты и стерилизуйте поверхности, с которыми щенки будут контактировать, используя 70% этанола. Пример репрезентативного оборудования, необходимого для выполнения трансплантации, и репрезентативной процедурной зоны показан на рисунке 2.
   Примечание: Несмотря на то, что эта процедура представляет собой инъекцию небольших объемов, а не хирургическую процедуру, которая потребовала бы разреза, открытой раны или наложения швов, все же рекомендуется использовать новую микропипетку для каждой инъекционной мыши. Микропипетки подвергаются термической стерилизации при вытягивании и снятии фаски на поверхности, которая была распылена 70% этанолом и хранится в герметичном контейнере.
   1. Сгенерируйте микропипетки с диаметром на кончике от 40 до 80 мкм. Следование этим параметрам даст оптимальные результаты. Подвергните термической стерилизации микропипеток при натяжении и скосе на поверхности и распылите 70% этанола перед хранением микропипеток в герметичном контейнере.
      Примечание: В качестве альтернативы, если доступ к устройствам, необходимым для создания этих игл (Таблица 1), ограничен, используйте любое другое инъекционное устройство. Однако они могут не так хорошо подходить, как микропипетки, из-за разного диаметра.
   2. Наберите минеральное масло в шприц объемом 1 мл и с помощью иглы 30 1/2 G полностью заполните стеклянную пипетку минеральным маслом. Затем установите поршень на стереотаксическое устройство, затем прикрепите стеклянную пипетку к стереотаксическому устройству и загрузите его на поршень. С помощью гидравлического привода переместите поршень примерно наполовину внутрь стеклянной пипетки, удаляя вылившееся минеральное масло чистым бумажным полотенцем.
      1. В качестве альтернативы использованию шприца, погрузите задний конец пипетки в минеральное масло и заполните капиллярным действием. Чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха в пипетке, поддерживайте положительное давление на шприц до полного выхода из стеклянной пипетки.
         заметка: Для успешной трансплантации клеток MGE можно использовать и другие устройства. Для этой процедуры хорошо подходит любое устройство, которое может выдавать объем меньше или около 100 нл.
   3. Затем используйте стерильное бумажное полотенце или любой абсорбирующий материал, загнутый в тонкое острие, чтобы аккуратно удалить излишки среды над гранулой ячейки MGE. На этом этапе плотность клеток концентрируется таким образом, что можно достичь меньших объемов впрыска. Затем с помощью пипетки малого объема (предпочтительно P2) медленно набирайте клеточную гранулу и растирайте 1-2 раза, прежде чем переместить клеточную суспензию на гидрофобную поверхность. Объем должен быть чуть менее 1 μл. Переместите кончик иглы в клеточную подвеску и с помощью гидравлического привода втяните клеточную суспензию в пипетку.
   4. Обезболите щенка P1 с помощью гипотермии (заверните в латексную перчатку и положите на лед на ~2-4 минуты). Проверьте эффективность анестезии с вредным раздражителем. Тонкими щипцами защемите кожу между пальцами ног: щенок должен не реагировать, если его защипать. Затем поместите щенка на форму, которая находится под устройством для инъекций, затем натяните кожу, оттянув кожу на голове и закрепив ее стандартной лабораторной лентой><. заметка: В то время как гипотермия очень эффективна для новорожденных мышей и приводит к низкому уровню смертности, процедуры должны быть выполнены быстро, так как щенки начнут восстанавливаться менее чем через 10 минут. Кроме того, 4 минуты на льду – это верхний предел допустимого значения. Старайтесь вызывать гипотермию только один раз, если для инъекций требуется больше времени. Однако, если щенок выздоравливает на ранней стадии, сначала дайте ему полностью восстановиться, прежде чем снова вызывать гипотермию. Более того, для выполнения инъекций нужно только один раз вызвать гипотермию. Детеныши выздоровеют в течение 5-10 минут после переохлаждения. Этому можно способствовать, поместив щенков с подстилкой и мамой или поместив щенка на теплую поверхность для восстановления.
   5. С помощью стереотаксического устройства расположите кончик стеклянной пипетки на поверхности головы щенка, перпендикулярно поверхности головы. Когда пипетка соприкасается с головкой, считайте это значением «0». Затем протолкните пипетку через поверхность кожи и черепа в кору головного мозга, затем вставьте и втяните пипетку ~ 2 раза перед остановкой. Для оптимального нацеливания клеток в неокортекс инъекции проводятся, когда микропипетка находится на глубине 0,1 мм. Тем не менее, это должно быть оптимизировано пользователем (см. примечание ниже).
      заметка: В то время как эта глубина надежно нацелена на более глубокие слои неокортекса с помощью описанных выше устройств, несколько глубин должны быть проверены и определены эмпирически. Кроме того, следует протестировать диапазон глубин в различных ростро-каудальных и медиолатеральных положениях, чтобы определить, какая глубина является оптимальной на каждом участке. Кроме того, первоначальная пункция должна быть быстрой, так как медленное проникновение в неокортекс снижает способность к чистому проникновению в ткани. Попробуйте разные скорости при первом запуске этой процедуры, чтобы найти то, что работает лучше всего. Кроме того, для тестирования координат нет реальной замены использованию меченых клеток, поскольку красители были ненадежны для обозначения положения.
   6. Как только игла будет на месте, поверните гидравлическое устройство, чтобы продвинуть поршень в стеклянную пипетку, проталкивая заданный объем клеточной суспензии в кору головного мозга. Вносите 50-70 нлс на сайт. Повторите эту процедуру на 3-6 различных участках на разных рострально-каудальных уровнях, если цель состоит в том, чтобы получить широкое распределение клеток по всему неокортек><су. заметка: Объем 100 нл или более может вызвать поражение и привести к образованию больших скоплений введенных клеток, которые не могут эффективно мигрировать из места инъекции. Таким образом, оптимальными являются меньшие объемы впрыска (~70 нл или менее), на большее количество участков, если позволяет время.
   7. Когда инъекции будут завершены, удалите щенка из сцены и пометьте его (обрезание пальцев ног является надежным способом идентификации щенков в дальнейшем). Как только щенок выздоровеет и сможет самостоятельно передвигаться (это произойдет в течение нескольких минут после снятия его со сцены), поместите его обратно к маме и помету.
      заметка: Поскольку это минимально инвазивная процедура, после того, как щенок свободно двигается и согревается, никаких послеоперационных процедур не проводится. Тем не менее, щенков следует проверять не только после процедуры, но и на следующий день, чтобы убедиться, что у них нет признаков ухудшения здоровья.
   8. Перед началом процедуры на следующем щенке распылите на участок 70% этанола для поддержания стерильной рабочей зоны. Дайте введенным детенышам развиться, а затем оцените ткань на соответствующей стадии (стадиях) развития.

Таблица 1. Инвентаризационная ведомость реагентов и инструментов.Перечень коммерчески доступных реагентов, включая среды, инструменты для препарирования, репрезентативное оборудование для трансплантации и векторы ДНК. (н.а.) Недоступно или применимо.

гг. предприятии

Реагенты и оборудование для подготовки и трансдукции клеток MGE			Каталог #	компания
1)	Модифицированная среда Dulbecco's Eagle, с высоким содержанием глюкозы		12491-015	Технологии Life
2)	Термоинактивированная фетальная сыворотка крупного рогатого скота		10437-077 (Английский)	Технологии Life
3)	Сбалансированный раствор соли Хенкса (HBSS), без кальция и магния		14170-112	Технологии Life
4)	1,5 мл микроцентрифужные пробирки (или другие пробирки для сбора с крышками)		3810Х	Эппендорф Интернэшнл
5)	Полибрен		СК-134220	SantaCruz Biotechnology
6)	Нож прямой 22.5 ° (опционально)		Артикул 72-2201	Корпорация хирургических специальностей
7)	чашка Петри (10 см), для рассечения тканей		FB0875713	Научный центр Фишера
8)	2 щипца с тонким наконечником, как Dumont #5		11254-20	Точные научные инструменты
9)	37 °C инкубатор для культуры тканей с 5% вводомCO2		С150	сноповязалка
10)	Настольная центрифуга, которая может вращать микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл
11)	Любая пипетка P1000, которую можно использовать для растирания клеток
12)	Уровень биобезопасности 2
Реагенты и оборудование для первичных культур in vitro MGE			Каталог #	компания
1)	Лаб-ТекII предметные стекла с крышкой, 8 лунок		154941	Термо Фишер
2)	Поли-L-лизин 0,1% вес/объем		П8920	Сигма Олдрич
3)	Мышиный ламинин, 0.5-2 мг/мл		No 23017-015	Технологии Life
4)	Нейробазальная среда		No 21103-049	Технологии Life
5)	B27 добавка без сыворотки		17504044	Технологии Life
6)	Glutamax, 100x стоковый		35050-061 (Английский)	Технологии Life
7)	Пенициллин-стрептомицин, 100x стоковый		15070-063	Технологии Life
8)	Глюкоза, (приготовьте 25% раствор в воде)		Г5400	Сигма Олдрич
Реагенты и оборудование для трансплантации клеток MGE			Каталог #	компания
1)	1 мл шприц		ССЫЛКА 309602	BD, Becton Dickinson and company
2)	30 1/2 G игла		305106	BD, Becton Dickinson and company
3)	Прецизионное отверстие для подачи 5 мкл (поставляется с плунжером)		5-000-1005	Научная компания Драммонда
4)	Парафильм		ПМ-999	Polysciences, Inc.
5) **	Стереомикроскоп со штангой		МЗ6	Лейка
6) **	Цифровой стереотаксический инструмент только для мышей		51725Д	Стоельтинговая компания
7) **	Одноосевой масляный гидравлический тонкий микроманипулятор		МО-10	Нарисигэ
8)	Вращающийся фаска с алмазным покрытием		н.а.	Сделано на собственном
9)	Игольчатый пипетка		730	Инструменты Kopf
10)	Минеральное масло		н.а.	Любая аптека или аптека
11)	Любая пипетка и наконечники, которые могут надежно измерять объем 1 мкл
	** Это модели, которые мы используем, но многие другие настройки должны работать
Необязательные реагенты (для создания лентивирусов)			Каталог #	компания
1)	25 мм, фильтр 0.45 μм		09-719Б	Научный центр Фишера
2)	Ультрапрозрачные центрифужные пробирки (25 x 89 мм)		344058	Бекман Коултер®
3)	Липофектамин 2000	(объем 1,5 мл)	11668019	Инвитроген
Другие коммерчески доступные расходные материалы			Каталог #	компания
1)	pMDLg/pRRE кодирование плазмиды gag/pol		No 12251	Адджен
2)	pRSV-Rev кодирование плазмиды Rev		No 12253	Адджен
3)	pMD2.G плазмида кодирует VSVG		No 12259	Адджен
4)	pAAV-Flex-GFP		No 28304	Адджен

Результаты

Рисунок 1. Репрезентативная процедура рассечения ткани E13.5 MGE. Пример вскрытия ткани MGE для первичных культур или трансплантации. (A-E) Изображения вскрытия мозга E13.5 и (A'-E') схемы для выделения структур и важных этапов процедуры. (A, A') Репрезентативный E13.5 мозг с вентральной стороны. Красной линией обозначен первый сделанный разрез, кот...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагенты и оборудование для трансплантации клеток MGE
1 мл шприц	ССЫЛКА 309602	BD, Becton Dickinson and company
Игла калибра 301/2	305106	BD, Becton Dickinson and company
Прецизионное отверстие для подачи 5 μл (поставляется с плунжером)	5-000-1005	Научная компания Драммонда
Парафильм	ПМ-999	Polysciences, Inc.
Стереомикроскоп со штангой штанги **	МЗ6	Лейка
Цифровой стереотаксический прибор только для мышей **	51725Д	Стоельтинговая компания
Одноосевой масляный гидравлический микроманипулятор тонкой очистки **	МО-10	Нарисигэ
Вращающийся фаска с алмазным покрытием	н.а.	Сделано на собственном
Съемник игольчатого пипетки	730	Инструменты Kopf
нефтепродукт	н.а.	Любая аптека или аптека
Любая пипетка и наконечники, которые могут надежно измерять объем 1 мкл
** Это конкретные модели, которые мы используем, но многие другие настройки должны работать
Дополнительные реагенты (для изготовления лентивирусов)
25 мм, фильтр 0,45 μм	09-719Б	Научный центр Фишера
Сверхпрозрачные центрифужные пробирки (25 x 89 мм)	344058	Бекман Коултер®
Липофектамин 2000 (объем 1,5 мл)	11668019	Инвитроген
Другие коммерчески доступные расходные материалы
pMDLg/pRRE кодирование плазмиды gag/pol	No 12251	Адджен
Кодирование плазмиды pRSV-Rev	No 12253	Адджен
Плазмида pMD2.G, кодирующая VSVG	No 12259	Адджен
pAAV-Flex-GFP	No 28304	Адджен

предприятии