$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Все процедуры, связанные с животными моделями, были рассмотрены местным институциональным комитетом по уходу за животными и ветеринарным советом JoVE.
1. Предоперационная процедура
- Перед началом операции протрите все 70% этанолом для поддержания стерильных условий. Рекомендуется термическая поддержка с помощью грелки.
- Обезболивайте мышей путем внутрибрюшинной инъекции хлоралгидрата (400 мг/кг). Подтвердите обезболивание, выполнив щипывание пальцев ног. Рекомендуется использовать мелоксикам SR при индукции и бупренорфин после выздоровления BID (bis in die, два раза в день) в течение не менее 24 часов.
- Сбрейте волосы с помощью хирургической машинки для стрижки. Закрепите мышь в адаптере мыши и неонатальной крысы с помощью ушных планок и зажима для носа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно убедиться, что головка мыши закреплена на этом этапе и не движется из стороны в сторону.
- Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
2. Стереотаксическая хирургия для имплантации направляющей канюли
- Установите мышь и адаптер для новорожденной крысы на стереотаксический аппарат. Сделайте разрез сагиттально на коже над черепом с помощью скальпеля. Сотрите кровь и соединительную ткань с черепа с помощью влажной ватной палочки.
- Определите координаты интересующей области мозга с помощью атласа мозга. Перед началом измерений убедитесь, что средняя линия прямая, чтобы сверло можно было перемещать A-P и оставаться на среднем шве все время.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье используется координата (A/P: -3.1 мм, M/L: -2.5 мм, D/V: -1.2 мм, 12 градусов) для цели заднего гиппокампа.
- Уровень черепа A-P
- Прикрепите дрель на манипулятор стереотаксической рамы. Опустите сверло до тех пор, пока оно не коснется лямбды, и запишите его вентральную координату. Повторите эту процедуру для брегмы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда череп выровнен, вертикальное измерение брегмы равно измерению лямбды. Если нет, отрегулируйте высоту носового зажима соответствующим образом. После того, как череп будет выровнен, запишите переднюю/заднюю, латеральную координату брегмы.
- Уровень черепа левый-правый
- Переместите сверло из брегмы в координату (переднезадний [A/P]: -3,1 мм, медиолатеральный [M/L]: +2,0 мм), опустите сверло на череп и запишите вертикальную координату. Затем повторите эту процедуру для координаты (A/P: -3,1 мм, M/L: -2,0 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если череп выровнен, эти вертикальные измерения двух равноудаленных от средней линии точек равны. Если нет, отрегулируйте высоту ушных планок.
- Осторожно просверлите отверстие для заусенцев по целевой координате (A/P: -3,1 мм, M/L: -2,5 мм) для имплантации направляющей канюли. Если диаметр отверстия для заусенца недостаточно велик для имплантации направляющей канюли, просверлите еще одно отверстие, которое перекрывается с первым. Просверлите еще одно отверстие на правой (контралатеральной стороне) теменной кости и вставьте костный винт, который помогает закрепить стоматологический цемент в 1.10 (см. Рисунок 1B).
- Отрежьте круглую запорную деталь с тыльной стороны крышки центрифужной пробирки объемом 1,5 мл лезвием бритвы и сделайте «корону». Эта коронка используется для предотвращения растекания стоматологического цемента на коже. Поместите его на череп так, чтобы отверстия для заусенцев, сделанные на шаге 2.5, оставались внутри круга (см. Рисунок 1).
- Установите стереотаксический узел, надев направляющую канюлю на более короткий рычаг стереотаксического адаптера и закрепив его с помощью колпачковой гайки. Установите более длинный рычаг стереотаксического адаптера на электродный зажим. Прикрепите его к манипулятору стереотаксического аппарата (см. Рисунок 1A).
- Поверните дорсально-вентральный (D-V) стереотаксический узел на манипуляторе на 12 градусов (см. Рисунок 1B). Переместите направляющую канюлю к отверстию заусенца, сделанному в 1,6. Медленно введите направляющую канюлю в мозг, опустив ее на 1,2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Угол наклона зонда зависит от гиппокампа; Для других регионов могут потребоваться другие углы или вообще не потребоваться их отсутствие. Обратитесь к атласу мозга для получения точных координат. Высушите поверхность черепа, потому что в противном случае цемент не будет прилипать, и цементный колпачок может сместиться
- Добавьте стоматологический цемент внутрь коронки, чтобы полностью покрыть как металлическую часть направляющей канюли, так и костный винт достаточно для их фиксации. Наложите дополнительный стоматологический цемент, если есть обнаженная часть черепа.
- Дождитесь полного высыхания стоматологического цемента (~12-20 минут). Снимите стереотаксический адаптер с электродного зажима. Снимите колпачковую гайку и замените стереотаксический адаптер на фиктивный щуп и затяните колпачковую гайку.
- Освободите мышь от стереотаксического аппарата и поместите мышь одну в индивидуальную клетку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего положения на грудине. Проверяйте мышь ежедневно до дня проведения микродиализа. Мышь получает нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), такие как карпрофен, если кажется, что она испытывает боль. Для исследований сна и бодрствования необходимо подождать 2 недели, чтобы мышь привыкла к новой среде, но другие типы исследований могут потребовать более коротких периодов восстановления (, например, 1-2 дня).
3. Настройка микродиализа
- Проверка качества зондов: Наполните одноразовый шприц объемом 1 мл дистиллированной водой и подключите его к выходному отверстию (более короткому порту) зонда с помощью трубки byton. Закройте вентиляционные отверстия пальцами и осторожно нажмите на поршень шприца, чтобы вода попала в зонд. Убедитесь, что из входного отверстия зонда появляется вода и нет утечки на поверхности микродиализной мембраны.
- Активация зондов: Погрузите мембраны зонда в этанол (70-100%) на две секунды. Затем снова влейте дистиллированную воду в зонд с помощью шприца.
- Приготовление перфузионного буфера: Чтобы избежать адгезии молекул-мишеней к трубкам, добавьте БСА, разбавив 30% раствор БСА до 4% искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF: 1,3 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgSO4, 3 мМ KCl, 0,4 мМ KH2PO4, 25 мМ NaHCO3, 122 мМ NaCl, pH=7,35), что близко соответствует концентрации электролитов в спинномозговой жидкости, непосредственно перед использованием. Отфильтруйте перфузионный буфер через шприцевую фильтрующую установку с размером пор 0,1 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ: 4% бычий сывороточный альбумин (BSA) улучшает восстановление липких белков, но может серьезно ограничить доставку соединений, особенно для соединений с высоким уровнем связывания BSA. Это является одним из преимуществ использования более низкой концентрации БСА (например, 0,15%) в некоторых случаях. Обратите внимание, что BSA может очень легко агрегироваться при перемешивании вихрем или мешалкой. Эти агрегаты могут закупоривать зонды или мембранные поры. Будьте осторожны при подготовке решения BSA, чтобы ограничить эту агрегацию
- Подготовьте две отдельные линии для входа и выхода (см. Рисунок 1C) и соедините обе линии соединительной иглой. Наполните одноразовый шприц объемом 3 мл, наполненный перфузионным буфером, и соедините его с входным концом трубки с помощью иглы с тупым концом. Заполните всю трубку перфузионным буфером, запустив шприцевой насос.
- Остановите шприцевой насос и замените соединительную иглу между входной и выходной линиями активированным микродиализным зондом, как показано на шаге 3.3 (см. Рисунок 1C). Перед этой заменой наденьте колпачковую гайку на щуп.
- Установите роликовую трубку в выпускную трубку роликового насоса. Запустите шприцевой насос со скоростью 10 мкл/мин, а затем роликовый насос с немного более низкой скоростью потока (9,5-9,8 мкл/мин). Обязательно удалите все пузырьки воздуха во всей трубке, которые могут повлиять на восстановление при попадании в зонд.
- Обезболивайте мышь с шага 1.12 так же, как и на шаге 1.2. Наденьте ошейник для мыши на его шею. Снимите колпачковую гайку и фиктивный щуп и медленно введите микродиализный зонд от 3,4 через направляющую канюлю и затяните колпачковую гайку.
- Поместите мышь в клетку, подключенную к свободно движущейся системе, и привяжите мышь к ошейнику. Продолжайте использовать шприцевой и роликовый насосы с расходом, указанным на шаге 3.5, в течение не менее 1 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить ISF от бодрствующих животных, в этой статье используется свободно движущаяся система, где клетка сама реагирует на движение животного, чтобы предотвратить скручивание трубок. В качестве альтернативы можно использовать жидкостные вертлюги различных компаний.
- Остановите сначала роликовый насос, а затем шприцевой. Установите желаемую скорость потока. Запустите шприцевой насос на 20% быстрее, чем роликовый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если вы работаете со скоростью 1 мкл/мин, работайте со скоростью 1,2 мкл/мин. Оптимальная скорость потока должна быть определена опытным путем для каждой молекулы.
- Сбор проб ISF: поместите свободный конец выпускной трубки на охлаждаемый коллектор фракций.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящий объем образца варьируется в зависимости от анализов, используемых для анализа.
- После завершения эксперимента извлеките зонд. (При необходимости обезболите мышь.)Обрабатывайте восстановление мыши так же, как и в шаге 2.11. Анализируйте собранные МАСФ с помощью таких методов, как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или иммуноферментный анализ (ИФА).
- Чтобы промыть всю трубку после микродиализа, снова подсоедините входную и выходную трубки, заменив щуп соединительной иглой, и пропустите разведенный отбеливатель по всей трубке, а затем промойте ее водой. Высушите и храните для повторного использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Другие типы трубок приемлемы, однако, BSA в перфузионном буфере может засорять трубки с небольшим диаметром, поэтому эти трубки считаются одноразовыми. Трубки могут изнашиваться или засоряться после многократного использования, поэтому перед использованием убедитесь, что скорость потока постоянна.
