1. Флуоресцентное мечение клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Помечайте клеточные линии глиобластомы и микроглию флуоресцентными красителями 9. В качестве альтернативы можно создать клеточные линии, которые конститутивно экспрессируют флуоресцентные белки, такие как GFP/RFP.
- Пластинчатые клетки на 6 лунках планшета таковы, что они будут сливаться на 70 - 80% в день окрашивания. Для клеточной линии мышиной глиобластомы GL261 и клеточной линии глиобластомы человека U87, пластину 1 x 106} и 1,5 x 106} клеток, соответственно, на чашке 6 см за 24 часа до окрашивания.
- Приготовьте флуоресцентный раствор красителя для клеток в ДМСО (диметилсульфоксиде) и добавьте 5 мкМ красителя в среду, либо в среду Мемориального института Розуэлл Парк (RPMI), либо в свободную среду с макрофагальной сывороткой (MSFM), в вихревую лунку.
- Инкубируйте клетки с красителем в течение 30 мин при 37 °C и 5% CO2.
- Удалите среду, содержащую краситель, и добавьте в клетки свежую среду (RPMI или MSFM).
- Инкубируйте клетки в течение 30 минут. Примечание: Теперь клетки окрашены и готовы к использованию в эксперименте.
2. Инвазионный анализ "3D"-встраивание глиомы и макрофагов/микроглии в матрицу
- Разморозьте матричную смесь при 4 °C на ночь. Все дальнейшие манипуляции выполняйте с помощью матрицы на льду в капоте.
- Приготовьте концентрацию матрицы 10 мг/мл в среде (MSFM или RPMI) с 0,3% BSA на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Исходная концентрация матрицы обычно составляет около 15 мг/мл.
- Чтобы подготовить клетки (помеченные на шаге 1) к суспензии в матрице, удалите среды из клеток с помощью аспирации. Вымойте клетки на чашке с 2 мМ ЭДТА (этилендиамина тетрауксусной кислоты)/PBS (фосфатно-солевой буфер). Добавьте в клетки 500 мкл 2 мМ ЭДТА/ПБС и инкубируйте в течение 5 - 10 мин при 37 °C и 5% CO2.
- Ресуспендируйте клетки в 5 мл среды, содержащей 0,3% БСА.
- Центрифуга в течение 5 мин при 120 x g.
- Аспирируйте надосадочную жидкость из гранулы. Ресуспендируйте гранулы в среде/0,3% БСА таким образом, чтобы концентрация клеток была равна 1 x 106 клеток/мл. Используйте гемоцитометр для подсчета клеток.
- Добавьте 1,5 x 105 клеток GL261 (в 150 μл) + 5 x 104 клеток микроглии (в 50 μл) в пробирку с микрофугой объемом 1,5 мл. Добавьте 2 x 105 клеток GL261 (200 μl) в отдельную микропробирку объемом 1,5 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки GL261 сами по себе без микроглии служат контролем.
- Вращайте клетки в микрофуге в течение 5 мин при 120 x g.
- Ресуспендируйте клетки в холодной матрице объемом 200 мкл на льду.
- Нанесите пластину 50 мкл (50 000 ячеек) на центр верхнего отсека вставки с размером пор 8 мкМ.
- Инкубировать при 37 °C в течение 30 минут, чтобы произошла полимеризация.
- Добавьте 200 мкл бессывороточной среды в верхнюю камеру и 700 мкл сывороткосодержащей среды для роста клеток в нижнюю лунку.
- Инкубировать при 37 °C, 5% CO2 в течение 48 часов.
- После инкубации удалите клетки из верхней части камеры с помощью щадящей аспирации и зафиксируйте камеры, поместив их в 3,7% формальдегид в PBS. Дайте камерам оставаться в фиксаторе в течение 15 минут при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 °C). Удалите фиксатор с помощью щадящей аспирации и замените на 500 мкл 1x PBS. Перейдите к разделу 4 для анализа изображений.
