Вирусная инфекция нейральных стволовых клеток плода вирусом Зика

Аннотация

Источник: McGrath, E. L., et al., Вирусная инфекция вирусом Зика культивируемых нейронных стволовых клеток мозга человеческого плода для иммуноцитохимического анализа. J. Vis. Exp. (2018)

В этом видео показана процедура инфицирования нервных стволовых клеток плода человека вирусом Зика. Инфицированные клетки могут быть использованы для дальнейших исследований.

Протокол

1. Вирусная инфекция Зика

ПРИМЕЧАНИЕ: ZIKV очень чувствителен к температуре, поэтому крайне важно, чтобы запасы ZIKV хранились при температуре -80 °C и чтобы избежать циклов замораживания/размораживания. Продолжайте работать аликвотами на льду.

1. Проходные клетки. Всего для засеивания 24-луночного планшета необходимо 3-4 миллиона клеток, поэтому при пассаже помещайте необходимое для заражения и посева количество клеток, необходимое для заражения и посева, в колбу при пассаже.
2. При посеве клеток в 24-луночный планшет для окрашивания подготовьте планшет [Покройте лунки, содержащие покровные стекла, 0,01% поли-D-лизина (PDL) в стерильной воде и инкубируйте в течение 1 ч при 37°С. Для 24-луночного планшета используйте 250 мкл PDL на лунку].
3. После пассирования поместите 1 мл клеточной суспензии в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугируйте при температуре 200 x g при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем удалите надосадочную жидкость путем аспирации.
4. Ресуспендируйте клеточную гранулу в запасе ZIKV для получения кратности инфекции (MOI) от 1 до 10. Объем раствора ЗИКВа не должен превышать 0,5 мл. Для имитации обработки (контрольные клетки) ресуспендируют клетки в том же объеме и типе среды, которые используются в материале ZIKV.
5. Инкубировать над смесью клетки/ZIKV при 37 °C в течение 1 ч. Переверните пробирку 2-3 раза, а затем центрифугируйте смесь в течение 5 мин при 216 х г при комнатной температуре до получения клеточной гранулы. Повторно суспендируйте гранулу в dPBS и снова центрифугируйте в течение 5 мин при 216 x g при комнатной температуре.
6. Удалите надосадочную жидкость путем аспирации, ресуспендируйте клетки соответствующей средой и загрузите инфицированные клетки в колбу или планшет, необходимые для эксперимента. При посеве клеток в 24-луночный планшет ресуспендируйте гранулу в 12 мл соответствующей среды, а затем добавьте по 500 мкл суспензии в каждую лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе либо поддерживайте клетки в питательных средах, чтобы наблюдать за воздействием ZIKV на стволовые клетки, либо переходите к шагам 6 или 7 для изучения влияния ZIKV на процесс дифференцировки.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM	Gibco	11965-092
F12	Гибко	11765-054
Глюкоза (10%)	Сигма	G8644
ГЕПЕС (1М)	Corning/cellgro	25-060-c1
Перо стрептококк (100x)	Gibco	15140-122
Инкубатор с углекислым газом	Термоформа	Модель# 3110
Центрифуга	Термофишер Научный	75004221
Шкаф биологической безопасности	Forma scientific Claas II A/B3	Модель# 1284
Поли-D-лизина гидробромид (PDL)	Сигма	П6407-5МГ
Ламинин	Invitrogen	23017-015