Стимуляция сенсорных нейронов ганглия дорсального корешка с помощью агониста нейропептидных рецепторов

Аннотация

Источник: Lin, Y., et al., Изоляция ганглиев дорсальных корешков и первичная культура для изучения высвобождения нейротрансмиттеров. J. vis. exp. (2018)

В этом видео показано использование трансфицированных ганглиозных клеток дорсального корешка для изучения высвобождения нейротрансмиттеров путем стимуляции их агонистом нейропептидных рецепторов.

Протокол

1. Высвобождение нейротрансмиттеров из первичных клеток DRG

1. На 6-й день, после того, как клетки были покрыты (через 72 ч после трансфекции миРНК), смените питательную среду на 200 мкл бессывороточной среды и инкубируйте клетки в инкубаторе с температурой 37 °C CO₂ в течение 30 мин.
2. Добавьте 1 μл химических веществ для стимуляции и аккуратно перемешайте среду с помощью пипетирования. Инкубируйте чашку в инкубаторе с температурой 37 °C CO₂ в течение назначенного времени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой статье культивируемые клетки стимулировали агонистом NPFFR2, dNPA (D.Asn-Pro-(N-Me)Ala-Phe-Phe-Gln-Pro-Gln-Arg- Phe-NH2, 5 нмоль), в течение 1 ч.
3. Соберите питательную среду из питательной чашки и центрифугируйте при давлении 5 000 x g в течение 5 минут при 4 °C, чтобы удалить любые взвешенные примеси.
4. Соберите надосадочную жидкость из центрифугирования и при необходимости разбавьте образцы фосфатно-солевым буфером (PBS). Затем используйте наборы для иммуноферментного анализа (ИФА) для определения уровня нейротрансмиттеров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь надосадочная жидкость была разбавлена в соотношении 1:100 перед анализом уровня CGRP. Надосадочная жидкость не разбавляли до анализа уровня SP.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
DMEM-F12	Invitrogen	12400024	Культуральная среда
Сбалансированный солевой раствор Хэнка	Инвитроген	14170-112	Культуральная среда
Пипетка Пастера	Хильгенберг	3150102	Клеточное растирание
dNPA	Синтез геномеда	Н/Д	Агонист NPFFR2