Методическая статья

Изучение трансмиграции лимфоцитов через монослой микрососудистых эндотелиальных клеток

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Источник: Schulte-Mecklenbeck, A., et al., Анализ экстравазации лимфоцитов с использованием модели гематоэнцефалического барьера человека in vitro. J. vis. Exp. (2017)

Это видео демонстрирует экспериментальное исследование трансмиграции лимфоцитов через модель эндотелия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Монослой микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга человека (HBMEC) генерируется in vitro, и к нему добавляются мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), содержащие лимфоциты. Затем клетки инкубируются для обеспечения трансмиграции лимфоцитов, а мигрировавшие клетки количественно оцениваются с помощью проточной цитометрии.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Приготовление вкладышей для клеточных культур

  1. Нанесение покрытий на вставки для клеточных культур
    Важное примечание: Избегайте прикосновения к мембране вставок клеточной культуры.
    1. Добавьте 100 мкл раствора фибронектина в каждую вставку для клеточной культуры (Рисунок 1A) и одну лунку 96-луночной пластины с плоским дном (оптическая контрольная лунка). Выдерживать не менее 3 ч при 37 °C. После инкубации раствор аспирата фибронектина.
    2. Добавьте 100 мкл суспензии HBMEC во вставки для клеточных культур и в лунку оптического контроля. Добавьте 600 мкл среднебазальной среды эндотелиальных клеток (ECM-b) в нижний отсек вставок для клеточных культур. Инкубируйте в течение 3 - 4 дней при 37 °C / 5% CO2 до тех пор, пока не будет достигнута целостность барьера (Рисунок 1B), проверьте рост клеток путем микроскопической оценки HBMEC в оптической контрольной лунке.
      Примечание: Рост клеток дольше четырех дней не рекомендуется.

2. Миграционный анализ

  1. Получение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ).
    1. Добавьте 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 200 мкл добавки B27. Подсчитайте PBMC и центрифужные ячейки при 300 x g в течение 5 минут. Повторно суспендировать PBMC до конечной концентрации 5 x 106 клеток/мл RPMI/B27.
  2. Настройка анализа миграции
    1. Аспирация среды из нижнего отсека, а затем верхний отсек вставок для клеточных культур, содержащих сливающиеся монослои HBMEC (Рисунок 1A). Для каждого донора добавьте по 100 мкл суспензии PBMC к вкладышам для клеточных культур, а также в одну лунку 24-луночного планшета на (in vitro контроль).
    2. Добавьте 600 мкл RPMI/B27 в нижний отсек вставок для клеточных культур и 500 мкл в PBMC контрольной группы in vitro и инкубируйте 6 ч при 37 °C / 5% CO2.
  3. Уборка урожая мигрировавших МПБК
    1. Извлеките вкладыш для клеточной культуры с помощью щипцов и осторожно промойте дно 400 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS), не касаясь мембраны. Выбросьте вкладыш для клеточной культуры.
    2. Добавьте флюоросферы с подсчетом потока 20 мкл (приблизительно 1000 гранул/мкл) в нижний отсек вставки для клеточной культуры, а также в контрольную часть in vitro и хорошо перемешайте. Перенесите 1 мл полученной суспензии PBMC в пробирки проточной цитометрии.

3. Проточная цитометрия

  1. Подготовка образцов
    1. Центрифугируйте PBMC при давлении 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре.
    2. Приготовьте раствор антитела путем добавления фторконъюгированных антител в буфер для проточной цитометрии объемом 100 мкл (PBS/1% бычьего сывороточного альбумина [BSA]/2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА]) на образец. Для получения результатов, представленных ниже, использовали 1 мкл CD4-FITC (кластер дифференцировки 4-флуоресцеина изотиоцианата), 1 мкл CD3-PerCP/Cy5.5 (белок хлорофилла перидинина/цианин 5.5), 1 мкл CD56-PC7 (фикоэритринцианин 7), 1 мкл CD8-A700 (Alexa fluor 700) и 1 мкл CD16-A750 (Alexa fluor 750).
    3. Повторно суспендировать PBMC в 100 мкл раствора антитела и инкубировать в течение 30 мин при 4 °C.
    4. Добавьте буфер для проточной цитометрии объемом 250 мкл и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Рисунок 1: Дифференциальная миграция субпопуляций NK-клеток через невоспаленные и воспаленные монослои HBMEC. А.Изображение трансвелловых вставок (слева) и иллюстрация экспериментальной установки (справа). B. Проверка барьерных функций HBMEC. Слева: иммуногистохимическое окрашивание молекулы плотного соединения ZO-1 с использованием античеловеческого zonula occludens-1 (ZO-1, abcam, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
PBSGibco14190-094без CaCl2 или MgCl2
Фибронектин 1 мг/млСигмаФ1141-5МГиз бычьей плазмы
ХБМЕКScienCell1000
ХБМЕКПелобиотехПБ-Н-6023
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
Пенициллин/стрептомицинScienCell1001-b
Добавка для роста эндотелиальных клетокScienCell1001-b
ТрансвеллКорнинг3472прозрачный, диаметр 6,5 мм, размер пор 3,0 мкм
96-луночная плоская донная пластинаКорнинг3596
В27Gibco17504-04450x концентрированный
48-луночный планшетКорнинг3526
RPMI 1640Gibco61870-010
Количество потоков флюоросферБекман Коултер7547053
Na-EDTAСигмаЕ5134
BSAСигмаА2153
CD3-PerCP/Cy5.5Биолегенда300430клон UCHT1
CD56-PC7Бекман КоултерА21692клон N901
CD16-A750Бекман КоултерА66330клон 3G8
CD4-FITCБиолегенда300506клон RPA-T4
CD8-A700Бекман КоултерА66332клон B9.11

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Transwell

Похожие статьи