Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Определение зоны инфаркта
- Измерьте зону инфаркта (ИЗ) через 24 ч после окклюзии средней мозговой артерии (MCAO).
заметка: Крысы, которые потеряли более 20% своего веса или у которых развились судороги или гемиплегия, исключаются из эксперимента.
- Усыпьте крысу, заменив вдыхаемую газовую смесь на 20% кислорода и 80% углекислого газа до тех пор, пока крыса не перестанет самопроизвольно дышать.
- Вскройте грудную клетку с боковым разрезом на 5-6 см через брюшную стенку под грудной клеткой с помощью ножниц и хирургических щипцов.
- Выполнить диафрагмальный разрез по всей длине грудной клетки ножницами и хирургическими щипцами.
- Аккуратно смещая легкие, прорежьте грудную клетку вверх до ключиц с правой и левой стороны.
- Перфузируйте 200 мл нормального физиологического раствора через левый желудочек сердца.
- Проколите или надрежьте ножницами правое предсердие сердца.
- Проведите обезглавливание с помощью гильотины и соберите мозговую ткань.
- С помощью ножниц для радужной оболочки глаза разрежьте от большого затылочного отверстия до дистального края задней поверхности черепа с обеих сторон.
- Отделяют от мозга обонятельные луковицы, нервные связи вдоль вентральной поверхности и дорсальной поверхности черепа.
- Удалите мозг из головы.
- Изготовьте 6 срезов мозга, создав горизонтальные срезы толщиной 2 мм с помощью лезвия бритвы из нержавеющей стали .009 дюйма без покрытия.
- Инкубировать в течение 30 минут при 37 °C при 0,05% TTC.
- Поместите мозговую ткань на предметные стекла микроскопа и выполните оптическое сканирование этих 6 срезов мозга с разрешением 1600x1600 точек на дюйм (см. рис. 1 для примера).
- Добавьте синий фильтр с помощью фоторедактора (например, Adobe Photoshop CS2) с помощью функции Микшер каналов (Image > Adjustments > Channel Mixer) и сохраните изображение в формате JPEG.
>заметка: После применения синего фильтра изображение будет выглядеть в оттенках серого.
- Откройте сохраненное изображение в ImageJ 1.37v.
заметка: Эта компьютерная программа использует пороговую функцию для выделения и вычисления пикселей, которые являются черными или белыми (см. рис. 2).
- Для каждого из 6 срезов мозга на изображении выберите и сохраните каждое полушарие (правое поврежденное ипсилатеральное и левое неповрежденное контралатеральное) в виде отдельного файла изображения с помощью инструмента «выделение полигона» в главном меню.
- Установите пороговое значение для определения IZ с помощью функции автоматического порога в главном меню программного обеспечения ImageJ, выбрав Image > Adjust > Threshold, и измерьте количество пикселей в каждом полушарии одного набора мозга.
>заметка: Для этого шага в программном обеспечении ImageJ можно использовать макросы (код см. в дополнительном документе 1). Отсечка является критическим параметром для определения того, какие пиксели следует преобразовать в белый, а какие — в черный в зависимости от оттенка серого (см. Рисунок 3 и Рисунок 4 в качестве примера). Затем ImageJ сравнивает белые и черные пиксели для определения IZ. Исходя из протокола окрашивания и настроек сканера, мы использовали постоянное пороговое значение 0,220.
- Выполните измерение коррекции IZ при отеке тканей с помощью метода соотношений ипсилатеральных и контралатеральных полушарий головного мозга (RICH) (см. пример на рисунке 5).
заметка: Размер инфаркта оценивается в процентах от контралатерального полушария.
2. Определение отека мозга
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ImageJ 1.37v для измерения отека мозга (БЭ).
- Измерьте BE через 24 ч после MCAO. Для расчета БЭ используются данные об объеме левого и правого полушария (в единицах).
- Выполните оптическое сканирование с разрешением 1600x1600 точек на дюйм (см. Рисунок 1 для примера).
- Выделите полушария мозга и установите порог для определения ПБ с помощью ImageJ 1.37v, как описано выше в разделах 1.17-1.19.
- Выразите площадь BE в процентах от стандартных площадей непораженного контралатерального полушария, рассчитанного методом RICH с использованием следующего уравнения (см. пример на рисунке 5).
заметка: Степень ПБ оценивается в процентах от контралатерального полушария.
