Оценка трансэндотелиального электрического сопротивления в модели гематоэнцефалического барьера in vitro

Аннотация

Источник: Кузманов, И., и др. Модель гематоэнцефалического барьера in vitro с использованием импедансной спектроскопии: фокус на взаимодействии Т-клеток с эндотелиальными клетками. J. Vis. Exp. (2016)

Это видео демонстрирует метод оценки трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) в микрососудистых эндотелиальных клетках мозга мыши in vitro. Высокое значение TEER указывает на интактные соединения эндотелиальных клеток, в то время как добавление активированных Т-клеток снижает значение TEER, отражая нарушение соединительного барьера.

Протокол

1. Настройка и выполнение измерения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER)

1. Поместите 24-луночный модуль прибора для измерения трансэндотелиального электрического сопротивления (TEER) под колпак ламинарного потока. Снимите крышки и с помощью щипцов поместите в инструмент вставки с первичными микрососудистыми эндотелиальными клетками мозга мыши (MBMECs).
2. Пипетку 810 мкл свежей среды в нижний отсек модульной лунки: осторожно добавьте ее между вкладышем и стенкой модульной лунки.
3. Закройте крышки и поместите инструмент в инкубатор. Подключите прибор к компьютеру; Включите контроллер прибора и откройте программное обеспечение.
4. Выберите «Новое измерение» во всплывающем окне. Отметьте галочками поля 'show TEER' и 'show Ccl'; После завершения первого измерения выберите «проверить все скважины» на вкладке «результаты», чтобы увидеть все значения TEER и емкости слоя ячейки (Ccl).
5. Сохраните файл: Файл>Сохранить как>' имя вашего файла'.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку TEER и Ccl постоянно измеряются автоматически, отслеживайте их значения в течение периода от трех до пяти дней. Смена среды не является необходимой, если только жизнеспособность клеток не является неоптимальной, что визуализируется по отсутствию увеличения TEER.
6. Выберите момент времени для совместного культивирования MBMEC с Т-клетками, когда Ccl стабилен и ниже 1 мкФ/см², а TEER достиг своего максимального уровня.
7. Тщательно проверьте абсолютные значения TEER и Ccl и исключите скважины, в которых MBMEC не развили достаточно сливающихся монопластов, сняв с таких скважин галочки.
8. Сгруппируйте остальные скважины: щелкните правой кнопкой мыши по скважине и выберите «Добавить скважину в новую среднюю скважину». Назовите его во всплывающем окне; То же самое проделайте для всех отдельных скважин, которые будут сгруппированы.
9. Проверьте все средние скважины, чтобы убедиться, что все они имеют одинаковые начальные условия до сокультуры. Если некоторые из них имеют значительно отличающиеся абсолютные значения TEER или наклоны TEER, или стандартные ошибки слишком велики, повторите группировку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная группировка скважин обеспечивает минимальные колебания значений TEER внутри и между экспериментальными группами.
10. Во вкладке "эксперимент" нажмите "пауза", отсоедините прибор и достаньте его из инкубатора. Снимите крышки под ламинарным вытяжным колпаком.
11. По желанию подготовьте предварительно активированные и/или наивные Т-клетки со специфическими цитокинами, антителами или другими веществами или без них. Например, смешайте очищенное нативное/низкоэндотоксинное (NA/LE) антитело крысы к мышиному интерферон-гамма (ИФН-γ) (клон XGM1.2) с подготовленными Т-клетками в концентрации 20 мкг/мл на лунку прибора TEER.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются такие вещества, как ингибитор гранзима В, они добавляются в культуру Т-клеток в начале стимуляции Т-клеток: , например, , ингибитор гранзима В II (Calbiochem) смешивают с изолированными Т-клетками в конечной концентрации 10 мкМ в диметилсульфоксиде (ДМСО).
12. Удалите часть носителя из вкладыша (отсека верхнего колодца). Пример: осторожно отпидайте пипеткой объемом 150 мкл (следует избегать удаления всей среды, так как она может нарушить монослой MBMEC).
13. Добавляйте Т-клетки в MBMEC путем тщательного пипетирования 150 мкл среды, содержащей 2 x 10⁵ клеток/вставка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При сборе предварительно активированных Т-клеток учитывайте только взрывные Trypan Blue-free клетки.
14. Закройте крышки и поместите инструмент обратно в инкубатор. Снова подключите прибор и нажмите «Возобновить измерение». Через 24 часа нажмите «стоп» во вкладке «эксперимент» и сохраните файл (File>Save).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
cellZscope	nanoAnalytics GmbH	www.nanoanalytics.com	включая: 24-луночный модуль ячейки, контроллер, ПК с программным обеспечением cellZscope v2.2.2
Мембранные вставки Transwell - размер пор 0,4 мкм	Корнинг	3470	для измерения TEER в качестве основного считывания
Мембранные вставки Transwell - размер пор 3 мкм	Корнинг	3472	для измерения TEER в качестве контроля качества перед анализом трансмиграции Т-клеток
24-луночный планшет для культивирования клеток	Грейнер	650 180	с плоским дном; для языка и региональных параметров MBMEC
96-луночный планшет для культивирования клеток	Костар	3526	круглое дно; для культуры иммунных клеток
Счетная камера Нойбауэра	Мариенфельд	МФ-0640010	для подсчета ячеек
Коллаген IV типа из плаценты человека	Сигма	C5533	для решения для покрытия MBMEC
Фибронектин из плазмы крупного рогатого скота	Сигма	Ф1141-5МГ	для решения для покрытия MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)	Gibco	31966-021	для изоляции MBMEC и питательной среды MBMEC
Пенициллин/стрептомицин	Сигма	П4333	для изоляции MBMEC и питательной среды MBMEC
Гепарин	Сигма	H3393	для среды культуры MBMEC
Основной фактор роста фибробластов человека (bFGF)	ПепроТех	100-18B	для среды культуры MBMEC
IMDM + 1% L-глутамина	Gibco	21980-032	для среды для культуры Т-клеток
Рекомбинантный мышиный ИФН-γ	ПепроТех	315-05	для анализов на трансмиграцию Т-клеток
Рекомбинантный мышиный TNF-α	ПепроТех	315-01A	для анализов на трансмиграцию Т-клеток
NA/LE очищенное антитело к мышиному ИФН-γ	BD Biosciences	554408	клон XMG1.2; Рекомендуемая конечная концентрация: 20 г/мл
Ингибитор гранзима B II	Кальбиохим	368055	рекомендуемая конечная концентрация: 10 μM
Антитела к мышиному CD4 ТЭЛА	Биолегенда	116005	клон RM4-4; для анализа трансмиграции Т-клеток
Раствор трипана Блю, 0,4%	Термо Фишер Научный	15250061	для подсчета клеток