Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Перфузия и обработка тканей
- Обезболивайте мышей с помощью внутрибрюшинной инъекции кетамина (100 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Перед продолжением зажмите пальцы ног, чтобы подтвердить отсутствие реакции.
- Транскардиально перфузия ~50 мл ледяного 0,1М фосфатно-солевого буфера (DPBS) Дульбекко с последующим добавлением 4% параформальдегида (PFA) в 0,1М фосфатного буфера (PB).
ВНИМАНИЕ: PFA токсичен. Используйте средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с PFA.
- Извлеките мозги и погрузите их в 4% PFA в 0,1 М PB при 4 °C на 24 ч для постфиксации. Стирка с DPBS 3x.
- Замените на 15% раствор сахарозы в 0,1 DPBS на ночь, а затем 30% раствор сахарозы в 0,1 M DPBS в течение еще 48 часов при 4 °C.
- Извлеките ткань из раствора сахарозы и заморозьте в криотомного камере, предварительно настроенной на температуру -20 °C. Замороженные образцы можно хранить в герметичных пробирках при температуре -80 °C до разреза.
- Закладывайте ткани при оптимальной температуре резки в среде для встраивания (см. Таблица материалов) и устанавливайте их на диск для образцов. Разрезать последовательные срезы толщиной 30 мкм в корональной плоскости с помощью криотома и последовательно собрать все срезы в 24 луночные культуральные планшеты, заполненные раствором криопротектора (30% глицерин, 30% этиленгликоль, 40% DPBS; Рисунок 1A–C). Хранить в морозильной камере при температуре -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более толстые секции (например, 50 мкм) предпочтительнее, когда это возможно. Убедитесь, что секции находятся в порядке резки и что все секции полностью покрыты криопротектором. 96-луночный планшет может быть использован в качестве альтернативы 24-луночным планшетам для сбора срезов.
- Закройте лунки пластинчатым герметиком, чтобы предотвратить испарение и высыхание. Хранить тарелки при температуре -20 °C до дальнейшего использования. Срезы, хранящиеся при -20 °С, стабильны в течение нескольких месяцев для иммуногистохимии холинацетилтрансферазы (ChAT).
2. Систематический выбор разделов для IHC
ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо провести пилотное исследование, чтобы узнать общее количество разделов, необходимых для достижения приемлемого коэффициента погрешности (CE). Значение CE является выражением общей величины погрешности в процедуре выборки. Наименьшее значение представляет собой минимальную ошибку, а значение CE ниже 0,1 считается приемлемым программным обеспечением, используемым здесь (см. Таблица материалов).
- Определите первый и последний участки для каждого мозга, сравнив морфологические особенности со стандартным атласом мозга мышей, таким как атлас Франклина и Паксиноса. Базалис ядра Мейнерта или НБМ начинается на брегме -0,0 мм и заканчивается на -1,6 мм. Таким образом, около 50 разделов содержат НБМ. Общее количество секций является одним из параметров, необходимых при стереологии. Выбор каждого 8th сечения (SSF = 1/8) дал в общей сложности 6–7 сечений для анализа и дал приемлемый CE как для оценки объема, так и для оценки длины волокна в нашем пилотном исследовании.
- Случайным образом начните с одного из первых восьми разделов, а затем систематически отбирайте каждые 8th раздел, пока последний задний участок не содержит NBM (Рисунок 1C).
3. Иммуногистохимия
- Перенесите криоконсервированные секции до комнатной температуры в криопротектор, а затем 0,1М фосфатный буфер (ПБ) в 6-луночных планшетах.
- Стирать 3 раза в PB.
- Инкубировать в 0,3% H2O2 в метаноле в течение 15 мин.
- Умыться 3 раза в трис-буферном физрастворе (TBS).
- Инкубировать в 0,25% Triton X-100 в TBS в течение 30 мин.
- Блок с 10% нормальной бычьей сывороткой (NBS) в 0,1% Triton X-100 в TBS в течение 30 мин.
- Инкубировать с разведением 1:1000 первичных антител ChAT против человека коз (см. Таблица материалов) в TBS с 0,1% Triton X-100 и 1% NBS в течение 48 ч при 4 °C.
- Постирайте 3 раза в TBS при комнатной температуре. Выполняйте всю дальнейшую инкубацию и промывку при комнатной температуре.
- Инкубируйте с биотинилированными вторичными антителами крупного рогатого скота против коз (см. Таблица материалов) в течение 1 ч.
- Стирайте 3 раза в TBS.
- Инкубируйте с комплексом авидин-биотин–пероксидаза (см. Таблица материалов).
- Стирайте 3 раза в TBS.
- Разрабатывайте с использованием улучшенного раствора субстрата DAB-пероксидазы (см. Таблица материалов) в соответствии с рекомендациями производителя.
ВНИМАНИЕ: DAB является подозреваемым канцерогеном. Токсичен при контакте и вдыхании. Используйте СИЗ при работе с DAB.
- Пару раз промойте секцию дистиллированной водой и держите в Трис рН=7,6.
- Закрепите секции на желатинизированных предметных стеклах. Все срезы из одной ткани можно положить на одну и ту же горку. Высушите секции на воздухе, обезвожьте 2 раза в течение 5 минут каждая с помощью 70%, 90%, 95% и 100% этанола, а затем очистите секции двумя 10-минутными промывками ксилола. Застегните секции с помощью монтажного носителя (см. Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время обработки обезвоживания и очистки влияет на толщину секций. Поэтому для всех участков следует использовать одни и те же условия. В данном исследовании среднее значение для конечной толщины составило 21,11 ± 0,45 мкм.
- Держите секции в вытяжном шкафу до полного высыхания. Сухие участки готовы к стереологии.
