$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Синаптосомное поглощение дофамина
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для параллельной оценки двух мозгов, но он также может быть успешно использован для проведения экспериментов по поглощению синаптосомального дофамина (DA) с четырьмя мозгами параллельно.
- Препараты
- Маркировка 48 микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл в таблице 1 (по 24 на каждый мозг). Используйте разные цвета для трубок, принадлежащих каждому мозгу, чтобы избежать путаницы между образцами.
- Этикетка 51 сцинтилляционная трубка #1-51.
- Положите на лед фосфатно-солевой буфер (PBS). Это будет использоваться для охлаждения мозга.
- Включите центрифугу, чтобы дать ей предварительно остыть до 4 °C.
- Предварительно взвесьте две микроцентрифужные пробирки, чтобы получить точный вес ткани во время синаптосомной подготовки (раздел 2.6).
- Приготовьте гомогенизационный буфер, смешав 4 мМ HEPES и 0,32 М сахарозы. Отрегулируйте pH до 7,4 и держите на льду.
заметка: Гомогенизационный буфер можно хранить в аликвотах при температуре -20 °С и размораживать в день эксперимента.
- Приготовьте буфер для поглощения, комбинируя следующие компоненты: 25 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgSO4, 1 мМ аскорбиновую кислоту (0,194 г/л), 5 мМ D-глюкозу (0,991 г/л). Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH (приводит к концентрации натрия примерно 130 мМ) и держите на льду.
заметка: Для 2 мозгов приготовьте 1500 мл буфера для поглощения. Приготовьте поглощающий буфер в виде 10-кратного исходного раствора без аскорбиновой кислоты и глюкозы при температуре 4 °C. Приготовьте 1x рабочий раствор в свежем виде в тот же день, добавив аскорбиновую кислоту и глюкозу. Отрегулируйте pH с помощью NaOH до 7,4.
- Приготовьте буфер поглощения + лиганд, комбинируя следующее: 25 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgSO4, 1 мМ аскорбиновую кислоту (0,194 г/л), 5 мМ D-глюкозу (0,991 г/л), 1 мкМ паргилин, 100 нМ дезипрамин, 10 нМ ингибитор катехол-О-метилтрансферазы (COMT). Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH и оставайтесь на льду.
заметка: Используйте абсорбционный буфер объемом 50 мл и добавьте лиганд. Паргилин добавляется для предотвращения деградации DA путем окисления моноаминоксидазой (МАО). Ингибитор COMT (RO-41-0960) добавляется для предотвращения деградации DA (катехоламинов в целом) с помощью COMT. Дезипрамин добавляется для ингибирования поглощения через транспортеры норадреналина и серотонина и, таким образом, делает результаты поглощения специфичными для транспортера дофамина (DAT).
- Приготовьте абсорбирующий буфер + лиганд + кокаин (кок), комбинируя следующее: 25 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1,2 мМ CaCl2, 1,2 мМ MgSO4, 1 мМ аскорбиновую кислоту (0,194 г/л), 5 мМ D-глюкозы (0,991 г/л), 1 мкМ паргилин, 100 нМ дезипрамина, 10 нМ ингибитора COMT, 500 мкМ кокаина. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью NaOH и продолжайте работать на льду.
заметка: Используйте 7 мл абсорбционного буфера + лиганд и добавьте кокаин. Кокаин добавляют для получения фонового измерения неспецифического поглощения DA для вычитания из данных, оставляя только специфическое поглощение DAT (поскольку SERT и NET ингибируются дезипрамином, как описано выше). В качестве альтернативы вместо него можно использовать высокомощный и специфичный ингибитор DAT GBR-12935.
Важно: С этого момента держите все на льду.
- Синаптосомальный препарат
- Приносите в жертву по одной мыши за раз путем вывиха шейного отдела и обезглавливания.
- Разрежьте кожу ножницами, чтобы открыть череп, и отрежьте все лишние ткани позади черепа, оставшиеся после обезглавливания. Разрежьте череп маленькими прямыми ножницами вдоль sagittalis шва, заканчиваясь как можно кперед.
- Поместите два кончика ножниц в каждый глаз мыши и разрежьте череп, чтобы удалить оставшуюся часть черепа и неповрежденный мозг. Быстро удалите мозг и поместите его в ледяную PBS. Это позволит сохранить его холодным, пока второй мозг будет рассекаться.
- С помощью матрикса мозга рассеките корональный срез полосатого тела диаметром 3 мм (передне-задний: от +1,5 мм до -1,5 мм) с последующим более тонким рассечением с помощью перфоратора. Область пробивки приведена на рисунке 1.
- Держите салфетку на льду все время, двигаясь вперед.
- Переложите ткань в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл для взвешивания.
заметка: Этот вес будет использоваться в шаге 1.2.14.
- Повторите шаги 1.2.1-1.2.6 для второго мозга.
- После того, как будет получен вес для обоих видов мозга, перенесите ткань в гомогенизационный стакан, содержащий 1 мл ледяного гомогенизационного буфера.
- Гомогенизируйте ткань с помощью пестика с приводом от двигателя при 800 об/мин, 10 ровных взмахов.
заметка: Один удар равен одному действию вверх и вниз. Первый ход должен составлять около 5 с, последующие 3-4 с. Гомогенизация в изотонической среде важна для предотвращения разрыва синаптосом. Использование соответствующей силы и изотонической среды позволит пресинаптическим окончаниям повторно запечатать окружающую цитоплазму, синаптические везикулы, митохондрии и цитоскелет.
- Перенесите гомогенат в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и соберите оставшийся гомогенат из гомогенизационного стекла, промыв его 0,5 мл дополнительным гомогенизационным буфером.
- Держите образец на льду, пока ткани другого мозга гомогенизируются. Запустите два мозга параллельно в шагах 1.2.12-1.2.13.
- Гранулируйте ядра и клеточный мусор методом центрифугирования (1 000 x g, 10 мин, 4°C).
- Перенесите надосадочную жидкость (S1) (содержащую клеточные мембраны и цитоплазму) в новые микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл и центрифугуйте при давлении 16 000 x g в течение 20 мин при 4°C.
- Выбросьте надосадочную жидкость (содержащую цитоплазму) и ресуспендируйте гранулу (P2) (содержащую сырые синаптосомы) в 40 мкл гомогенизационного буфера/мг ткани (в расчете на вес, полученный на шаге 1.2.6). Осторожно ресуспендируйте сырую синаптосомальную фракцию с помощью пипетки p1000, так как слишком большое усилие приведет к разрыву синаптосом.
заметка: Важно, чтобы в итоге получилось не менее 280 μл. В противном случае необходимо разбавление более чем 40 мкл на мг. Шаги 1.2.1-1.2.13 должны быть выполнены как можно быстрее, и все должно быть уложено на лед. Как только сырые синаптосомы были ресуспендированы в гомогенизационном буфере, они становятся довольно стабильными до тех пор, пока они остаются на льду.
2. Эксперимент по поглощению
- Добавьте 440 мкл абсорбционного буфера + лиганд + кокаин в предназначенные для этого 12 микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл и 440 мкл абсорбционный буфер + лиганд в 36 оставшихся микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл (см. схему в Таблице 1).
заметка: Снимите их со льда за 15 минут до начала эксперимента, чтобы довести до комнатной температуры, но до тех пор держите на льду, чтобы сохранить ингибиторы.
- Подготовьте кривую насыщения (дофамин (2, 5, 6-[3H]-DA) (3-H дофамин) (91,1 Ди/ммоль) в различных конечных концентрациях (0,031, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1,0 мкМ)).
- Пометьте шесть микроцентрифужных пробирок объемом 2 мл как 10, 5, 2,5, 1,25, 0,62 и 0,31.
- Добавьте 750 мкл поглощающего буфера + лиганда в 5 микроцентрифужных пробирок с наименьшим количеством.
- Добавьте 1 455,4 мкл поглощающего буфера + лиганд, 14,6 мкл дофамина (1 мМ), 30 мкл 3-Н дофамина (11 мкМ) в пробирку с меткой 10.
- Переложите 750 мкл из пробирки с маркировкой 10 в пробирку с маркировкой 5. Хорошо перемешайте и переложите 750 μL из этой пробирки в 2,5 пробирки. Повторите это разведение с оставшимися трубками.
- Предварительно промойте стеклянные фильтры из микрофибры с помощью поглощающего буфера объемом 4 мл после установки их в ведро с фильтром на 12 лунок.
- Добавьте 10 мкл суспензии синаптосомальной мембраны в первые 24 микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл (см. схему в Таблице 1), содержащие буфер объемом 440 мкл. Осторожно сделайте вихрь и быстро поверните вниз, чтобы убедиться, что синаптосомы погружены в буфер. Оставьте при температуре 37 °C на 10 мин.<бр/>
заметка: Важно быть точным в отношении времени во время эксперимента по поглощению для справедливого сравнения между мозгами. Используйте секундомер для повышения точности.
- Добавить 50 мкл дофамина в концентрациях 10 и 5 мкМ (раздел 2.2) в первые два столбца и оставить при 37 °С на 5 мин с встряхиванием. Ровно через 5 минут остановите реакцию, добавив 1 мл ледяного буфера для поглощения. То же самое проделайте с концентрациями 2,5 и 1,25 мкМ (раздел 2.2), а затем с концентрациями 0,62 и 0,31 μМ.
- Добавьте образцы в предварительно промытые фильтры из микрофибры и промойте с помощью 5 x 4 мл ледяного абсорбционного буфера. Когда первые 12 образцов будут добавлены в фильтры, переместите фильтры в сцинтилляционные трубки. Повторите то же самое со следующими 12 образцами.
- Повторите шаги 2.4-2.6 для следующего мозга.
- Подготовьте 3 пробирки с максимальным счетом, поместив фильтр из микрофибры в дно сцинтилляционных пробирок 49-51 и добавив сверху 25 мкл максимальной концентрации дофамина (10 мкМ).
- Оставьте все 51 сцинтилляционную трубку в вытяжном шкафу на 1 час.
- Добавьте 3 мл сцинтилляционной жидкости в каждую сцинтилляционную пробирку и энергично встряхивайте на шейкере в течение 1 часа.
- Подсчитайте [3H]-DA в бета-счетчике в течение 1 мин.
- Откройте программу и выберите: Этикетка: H-3, Планшет/Фильтр: флакон 4 мл, 4 на 6, Тип анализа: Нормальный и Время подсчета: 1 мин.<бр/>
заметка: Этот шаг можно выполнить на следующий день, если это удобнее. Оставьте образцы накрытыми оловянной фольгой на ночь.
- Определение белка
- Используйте стандартный набор для анализа белка BCA для определения концентраций белка в синаптосомах для корректировки от количества в минуту (cpm) до fmol/min/μg и для правильного сравнения поглощения между образцами.
3. Анализ данных
- Используйте данные эксперимента по поглощению для построения кривой насыщения для каждой группы и вычисления скорости реакции (Vmax) и постоянной Михаэлиса Ментена (KM).
заметка: Значение KM отражает концентрацию субстрата, необходимую для достижения половины Vmax. Соответственно,Vmax напрямую отражает функцию DAT (максимальной поглощающей способности), которая зависит от количества DAT на поверхности и от того, как его активность может модулироваться посттрансляционными модификациями и/или взаимодействующими белками, а также от изменений ионных градиентов. Значение KM является косвенной мерой сродства субстрата к транспортеру, которое, что важно, также может модулироваться посттрансляционными модификациями и/или взаимодействующими белками. Поэтому для полной оценки функциональных изменений важно непосредственно определить уровни поверхностной экспрессии, например, с помощью анализа поверхностного биотинилирования.
Таблица 1: Схема микроцентрифужной пробирки для синаптосомального препарата.
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10 | 5 | 2.5 | 1.25 | 0,62 | 0,31 |
| 10+КОК | 5+КОК | 2,5+КОК | 1,25+КОК | 0,62+КОК | 0,31+КОК |
