Мечение заполненных биоцитином интернейронов в срезах гиппокампа крысы для визуализации

Аннотация

Источник: Economides, G., et al. Восстановление биоцитина и 3D-реконструкции заполненных интернейронов гиппокампа CA2. J. vis. exp. (2018)

В этом видео показана процедура окрашивания неподвижных срезов мозга крысы, содержащих интернейроны, заполненные биоцитином. Протокол включает инкубацию с авидин-биотиновым комплексом (АВК), окрашивание HRP и хромогенным субстратом, консервирование структур с помощью тетраоксида осмия и встраивание ткани в смолу для визуализации.

Протокол

Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных

1. Определение кальций-связывающего белка или содержания белка в интернейронах и визуализация биоцитина по электрофизиологическим записям и заполнению биоцитина

Примечание: В конце электрофизиологических записей срезы, содержащие заполненные биоцитином клетки, фиксируются на ночь перед гистологическими процедурами. Фиксирующий раствор будет заменен однократной заменой 0,1 М фосфатного буфера на следующее утро, если остальная часть процедуры проводится в другой день, чтобы предотвратить повреждение тканей. Фиксирующий раствор (4% параформальдегид, 0,2% раствор насыщенной пикриновой кислоты, 0,025% раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере (PB)) должен быть свежим в день записи для достижения наилучших результатов.

1. В конце электрофизиологической записи осторожно возьмите кистью срез, содержащий записанную клетку (клетки), и поместите его в горшок, содержащий искусственную спинномозговую жидкость (ACSF).
   заметка: Детали протокола, используемого для подготовки среза и внутриклеточной записи с помощью острых электродов, были описаны ранее.
2. В вытяжном шкафу аккуратно возьмите срез мозга кистью и раскатайте его по небольшому кусочку фильтровальной бумаги мелкого качества. Положите на ломтик еще один лист увлажненной фильтровальной бумаги и поместите два листа влажной фильтровальной бумаги в небольшую пластиковую кастрюлю, содержащую 5-10 мл фиксирующего раствора, и храните в холодильнике в течение ночи при температуре 4 °C.
3. Приготовьте раствор желатина в дистиллированной воде. Налейте 20 мл дистиллированной воды в стакан на горячую плиту и нагрейте ее до 60 °C. Постепенно добавляйте в воду 2,4 г желатина, дождитесь растворения и дайте ему остыть до 35–40 °C перед использованием, чтобы предотвратить повреждение тканей.
4. Замените фиксирующий раствор на 2 мл 0,1 М ПБ. Поместите ломтик в чашку Петри и срежьте лишнюю ткань лезвием скальпеля. Поместите обрезанную ткань в чашку Петри (диаметр 9 см, высота 1,4 см), следя за тем, чтобы она лежала ровно, без складок и заломов, и удалите излишки буфера сухой кистью.
5. Накройте ткань теплым желатиновым раствором и поместите чашку Петри на замороженный блок, чтобы быстро охладить раствор.
6. Используя угловую лампу для обеспечения контраста, посмотрите через боковую стенку блюда и держите ломтик плоским, слегка надавливая тонкой кистью, пока желатин не начнет схватываться.
   заметка: Желатин может быть повторно расплавлен, если ткань не лежит ровно. Любые дефекты на поверхности желатина, вызванные удалением кисти по мере ее затвердевания, можно устранить, аккуратно расплавив поверхностный слой, переместив колбу лампы близко к поверхности на несколько секунд.
7. Переместите тарелку с застывшим желатином в холодильник и оставьте при температуре 4 °C на 30-60 минут.
8. В вытяжном шкафу вырежьте небольшой блок (~ 1 x 1 см), содержащий залитую желатином ткань блюда, с помощью лезвия скальпеля, поднимите блок с помощью небольшого шпателя и осторожно поместите его в тот же, но свежий фиксирующий раствор, используемый для фиксации ломтиков, по крайней мере, на 30 минут при 4 °C.
9. Промойте желатиновый блок в 5 мл 0,1 М PB три раза, высушите его с помощью листа бумажной салфетки и наклейте блок стороной вверх (т.е. с салфеткой наверху) на вибратомный патрон с помощью суперклея.
10. Удалите излишки клея куском фильтровальной бумаги и с помощью лезвия скальпеля срежьте углы блока, оставив ромбовидную форму.
11. Разрежьте срез на толщину 50 мкм с помощью вибратома и осторожно поместите каждый срез в стеклянный флакон, содержащий 10% сахарозы.
12. Осторожно возьмите кусочек из флакона и поместите его в крышку чашки Петри. С помощью препарирующего микроскопа и свежего лезвия скальпеля удалите желатин вокруг среза и верните срез во флакон, содержащий 2 мл свежей 10% сахарозы
    заметка: Крайне важно удалить как можно больше желатина на этом этапе, чтобы уменьшить усадку тканей на этапе обезвоживания (Шаг 1.37).
13. Криозащитите секции в 0,1 М растворе сахарозы-глицерина на основе ПБ при комнатной температуре, инкубируя их в течение 10 мин в 10% растворе сахарозы, 20 мин в 20% растворе сахарозы-6% глицерина два раза и, наконец, 30 мин в 30% растворе сахарозы-12% глицерина два раза при постоянном перемешивании.
14. Положите секции на небольшой прямоугольник из оловянной фольги с помощью кисти. Удалите лишнюю жидкость из секций и аккуратно сложите фольгу в пакет.
15. Держите посылку близко к поверхности жидкого азота, не касаясь поверхности, в течение 30 с, а затем дайте секциям полностью оттаять в течение примерно 30 с. Повторите замораживание-размораживание еще два раза.
16. Удалите все срезы кистью и поместите их в стеклянный флакон, содержащий 2 мл 0,1 М ПБ, под постоянным помешиванием, чтобы смыть излишки сахарозы.
17. Удалите PB с помощью пастеровской пипетки и инкубируйте срезы в 2 мл 1% водной перекиси водорода (H,₂,_O2) в течение 30 мин. Промойте срезы в 2 мл 0,1 М PB 3x 5 мин.
18. Удалите 0,1 М PB с помощью пастеровской пипетки и добавьте 1 % боргидрида натрия (NaBH₄) в 0,1 М PB.
    заметка: Не закрывайте флакон крышкой, так как раствор NaBH₄ выделяет газообразный водород.
19. Удалите борогидрид натрия с помощью пастеровской пипетки и тщательно промойте срезы в 2 мл 0,1 М PB 5x 5 мин.
20. Замените 0,1 М ПБ на 10% нормальную козью сыворотку (NGS) в 0,1 М ПБ в течение 30 минут.
21. Удалите сыворотку от козы и инкубируйте срезы в течение ночи при температуре 4 °C в смеси моноклональных мышиных антител и поликлональных антител кролика, составленных в растворе ABC><. заметка: Список первичных антител, использованных в предыдущих исследованиях, представлен в таблице 1.
22. Инкубируйте срезы в течение 2 ч в темноте в смеси флуоресцентно меченных вторичных антител (Таблица материалов).
23. Закрепите секции на предметных стеклах в монтажном материале и накройте их покровным стеклом.
24. Сделайте снимки флуоресцентной маркировки при 40-кратном увеличении (рис. 1Bb).
25. После флуоресцентной визуализации поместите предметное стекло в стеклянную чашку Петри, содержащую PBS, и осторожно снимите покровное стекло. Затем промойте срезы со предметного стекла с помощью мягких импульсов PBS из пастеровской пипетки. Поместите срезы в чистый стеклянный флакон, содержащий PBS.
26. Проведите реакцию авидин-HRP, предварительно инкубировав срезы в ABC в течение не менее 2 ч для амплификации продукта реакции HRP.
27. Приготовьте раствор 3,5 диаминобензидина (DAB), добавив одну таблетку на 5 мл дистиллированной воды.
28. Промойте секции PBS три раза в течение 10 минут, а затем дважды с помощью буфера Tris в течение 10 минут. Снимите буфер Tris после последней промывки.
29. Быстро добавьте одну каплю 8 % раствора NiCl₂ (хлорида никеля) в раствор DAB, пипетируйте раствор внутрь и наружу для смешивания и быстро добавьте 1 мл этого раствора на срезы. Инкубируйте секции в растворе DAB/NiCl₂ в течение 15 минут.
30. Добавьте в раствор DAB 10 мкл 1% H₂O₂. Дайте реакции протекать в темноте при постоянном перемешивании в течение примерно 1-2 минут и следите за мечением заполненных клеток с помощью препарирующего микроскопа.
31. Остановите реакцию, удалив раствор DAB/NiCl₂/H₂O₂, и дважды промойте участки трис-буфером в течение 5 минут.
32. В вытяжной шкаф поместите небольшой круг фильтровальной бумаги в чашку Петри и смочите его 0,1 М ПБ. Поднимайте секции по одному из стеклянного флакона с помощью кисти и аккуратно кладите их на бумагу.
33. Накройте срезы еще одним смоченным кругом фильтровальной бумаги и удалите излишки буфера, осторожно прикоснувшись папиросной бумагой к поверхности.
34. Нанести 8–9 капель 1%-ного тетраоксида осмия в 0,1 М ПБ на верхнюю бумагу, накрыть посуду и выдержать в вытяжном шкафу не менее 30 мин, но не более 1 ч.
35. Откройте чашку Петри и поднимите верхнюю фильтровальную бумагу. Осторожно поднимайте секции по одному с помощью кисти, помещайте их в стеклянный флакон и дважды промойте в дистиллированной воде.
36. Утилизируйте отходы тетраоксида осмия надлежащим образом. Промойте весь одноразовый инвентарь и поместите его в соответствующие контейнеры.
37. Положите каждую секцию на предметное стекло и закройте секции. Переложите предметное стекло в чашку Петри, поместите пустой стеклянный флакон над покровным стеклом, чтобы удержать его на месте, и накройте 50% спиртом. Через 15 мин извлеките предметное стекло из раствора и удалите срезы со предметного стекла. Поместите секции обратно на предметное стекло, а затем поместите предметное стекло в 70% спирт на 15 минут. Повторите тот же процесс с 95% и, наконец, 100% спиртовым раствором.
38. После этапа обезвоживания переложите секции в стеклянный флакон, содержащий 100% спирт, на шейкер в вытяжном шкафу. Замените спиртовой раствор на оксид пропилена (C₃H₆O) и трижды простирайте в течение 5 минут. После последней промывки держите в флаконе ~2 мл оксида пропилена и добавьте смолу (соотношение 1:1). Убедитесь, что смола растворена, и держите секции под постоянным перемешиванием в течение 30 минут.
39. Поместите каждую секцию в алюминиевую доску, содержащую эпоксидную смолу, с помощью деревянной палочки и выдержите в течение ночи><. ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте секции в смоле дольше 24 часов, чтобы избежать риска их повреждения.
40. Поместите планшет на горячую плиту примерно на 10 минут. Возьмите каждую секцию деревянной палочкой и поставьте их на чистую горку. Поддерживайте постоянную ориентацию каждого сечения с помощью препарирующего микроскопа. Наденьте на секции покровную крышку. Поместите предметное стекло в духовку на 48 часов при температуре 56 °C для отверждения.

Таблица 1: Таблица решений.

Используемые решения	Состав/Инструкция
Решение для фиксации	4% параформальдегид, 0,2% раствор насыщенной пикриновой кислоты, 0,025% раствор глутарового альдегида в 0,1 М фосфатном буфере (ПБ)
0,1М фосфатный буфер pH 7,6	Добавьте 100 мл исходного фосфатного буфера 1 М в 900 мл дистиллированной воды
Фосфатно-солевой буфер (PBS) pH 7,4/7,5	Добавьте 10 мл 0,1М фосфатного буфера, 0,2 г KCl и 8,76 г NaCl в 990 мл дистиллированной воды
Буфер TRIS pH 7,5	Растворите 5,72 г гидрохлорида триса и 1,66 г основания триса в 50 мл дистиллированной воды. Затем вносят до 1 л дистиллированной воды.
Буферный фиксирующий раствор глутаральдегида и параформальдегида	4% параформальдегид, 0,2% раствор насыщенной пикриновой кислоты, 0,025% раствор глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере.
Решение ABC	Раствор должен быть приготовлен не менее чем за 30 минут до использования из набора ABC. Добавьте 1 каплю раствора А и 1 каплю раствора В к 2,5 мл PBS.
Эпоксидная смола Durcupan:	Сделать 20 горшочков: 20 г компонента А, 20 г компонента В, 0,6 г компонента С и 0,4 г компонента D-
	Защитите весы от попадания жидкости, накрыв пластину кругом фильтровальной бумаги. Тщательно взвесьте реактивы в стакан в указанных выше пропорциях. Тщательно перемешайте, энергично помешивая двумя деревянными палочками, в течение не менее 5 минут. Смесь должна стать равномерной плотности темно-коричневого цвета. Поместите стакан в духовку при температуре ~50 °C максимум на 10 минут, чтобы удалить как можно больше пузырьков воздуха. заметка: Смола начнет застывать, если оставить стакан в духовке дольше 10 минут. Сцедите смолу в пластиковые кастрюли или шприцы объемом 5 мл, датируйте их и храните в морозильной камере при температуре -20 °C готовыми к использованию.

Результаты

Рисунок 1: Нейронные реконструкции двух типов корзинчатых клеток, записанных и заполненных в области CA2 гиппокампа, и коррелированные электрофизиологические данные, полученные после внутриклеточных записей in vitro. Эта цифра была изменена по сравнению с предыдущими исследованиями. SO Stratum Oriens, SP Stratum Pyramidale, SR Stratum Radiatum, SLM Stratum Lacunosum Molecul...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Авидин-7-амино-4-метилкумарин-3-уксусная кислота (Авидин-AMCA) антитело - 20,8 мг/мл	Векторные лаборатории	А2008
Биоцитин ≥98% (TLC)	Сигма	В4261
3,5 таблетки диаминобензидина (DAB), Для приготовления 5 мл	Сигма	D4293
Эпоксидная смола Durcupan A	Сигма	44611
Эпоксидная смола Durcupan B	Сигма	44612
Эпоксидная смола Durcupan C	Сигма	44613
Эпоксидная смола D	Сигма	44614
Этанол, пурисс. годовых, абсолютный, ≥99,8%	Сигма	32221
Желатин	Сигма	48723
Раствор глутарового альдегида, марка I, 25 % в H2O	Сигма	G5882
Глицерин, ≥99%	Сигма	G5516
Козья сыворотка	Сигма	G9023
Козий антимышиный флуоресцеин изотиоцианат (FITC) - 14,3 мг/мл	Сигма	F2653
Козий антикроличий Техас Ред (TR) - 3,3 мг/мл	Инвитроген	Т2767
Перекись водорода, 30% раствор	Сигма	Н-1009
Погружное масло, вязкость 1.250 сСт (лит.)	Сигма	I0890
Хлорид никеля	Сигма	N5756
Тетраоксид осмия, для электронной микроскопии, 4% в воде	Сигма	75632
Параформальдегид, реагент, кристаллический	Сигма	P6148
Пикриновая кислота, смоченная водой, ≥98%	Сигма	197378
Фосфатный буфер 1 M	Сигма	P3619
Оксид пропилена, 99%	Альфа Аэсар	30765
Тетрагидроборат натрия	VWR	27885.134
Сахароза	Научный Фишер	С/8600/53
Тризма гидрохлорид, ≥99,0%	Сигма	Т5941
база Тризма, ≥99,9%	Сигма	Т6066
Vectashield Antifade Монтажная среда, показатель преломления 1.45	Векторные лаборатории	H-1000
Vectastain Elite ABC HRP kit	Векторные лаборатории	ПК6100
Используемое оборудование
Вибратом	Агар Научный
C4A Чашеобразные алюминиевые планшеты	GA-MA & ASSOCIATES, INC.
Микроскоп Leica DMR	Leica Microsystems
Источник флуоресцентного света X-Cite 120PC Q	Excelitas Technologies
Цифровая камера для микроскопа Leica DFC450	Leica Microsystems
Ручка для технического рисования Rapidograph 0,18 мм	Лондонский графический центр
0,18 мм наконечник рапидографа	Лондонский графический центр
Ручка для технического рисования Rapidograph 0,25 мм	Лондонский графический центр
0,25 мм наконечник рапидографа	Лондонский графический центр
Система Neurolucida, включающая в себя рабочую станцию ПК, сцену, камеру и джойстик для управления сценой XYZ	Microbrighfield (MBF) Bioscience
Версия программного обеспечения Neurolucida 2017	Микробригфилд (MBF) Бионаука
CorelDRAW graphics Suite X5	Корел
Программное обеспечение для редактирования видео	Adobe Premiere Pro
Стеклянные флаконы 14 мл	Научный Фишер