Оценка двигательных нарушений у моделей C. elegans с помощью радиального локомоционного анализа

Аннотация

Источник: Currey, H. N., et al. Оценка двигательных нарушений в моделях бокового амиотрофического склероза C. elegans. J. vis. Exp. (2021).

Это видео демонстрирует использование радиального анализа локомоции для оценки моторной дисфункции у C. elegans, экспрессирующих либо дикий тип, либо ALS-мутантный человеческий белок TDP-43. Червям с различными уровнями экспрессии TDP-43 дикого типа или мутантного типа разрешается ползать, и их движение измеряется радиальным расстоянием, пройденным от центральной точки на пластине для анализа. В анализе различают легкие, умеренные и тяжелые двигательные нарушения в зависимости от расстояния, пройденного различными штаммами C. elegans.

Протокол

1. Радиальный анализ локомоции

1. Приготовьте чашки Петри диаметром 100 мм или 150 мм, примерно наполовину заполненные нематодой питательной средой (NGM) и засеянные равномерным газоном из бактерий OP50, чтобы покрыть всю поверхность агара.
2. Переверните пластины для анализа NGM вверх дном и пометьте дно идентификатором штаммов C. elegans , подлежащих анализу, по 2 планшета на штамм (Рисунок 1A).
3. Сделайте маленькую точку маркером в центре перевернутой тарелки (Рисунок 1A).
4. Во время работы с препарирующим микроскопом перенесите 15-20 согласованных червей в центр анализной пластины прямо над центральной точкой (видимой через NGM) с помощью медиатора из платиновой проволоки (Рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Постарайтесь перенести всех червей одновременно или как можно быстрее.
   1. Установите таймер на 30 минут после того, как червячки будут помещены в центр тарелки. Закройте тарелку крышкой и отложите ее в сторону (Рисунок 1C).
5. Продолжайте перекладывать червей до тех пор, пока все штаммы не окажутся на обозначенных пластинах для анализа, отмечая, сколько примерно времени требуется для переноса между планшетами (стремитесь к ~ 1 минуте между планшетами). Храните все тарелки в том же порядке, в котором они были установлены.
6. Через 30 минут начните забивать первую тарелку.
   1. Снимите крышку и поместите пластину лицевой стороной вниз под микроскоп для препарирования таким образом, чтобы задняя часть пластины с маркировкой была обращена вверх, а агар NGM находился между линией взгляда и червями. Пластина будет перевернутой от обычного использования.
   2. Отрегулируйте фокус микроскопа до тех пор, пока черви не станут видны через агар.
   3. Используя фломастер другого цвета от центральной точки, поставьте маленькую точку в месте расположения каждого червячка - пройдите по следам червей через бактериальную лужайку, чтобы найти самых дальних животных.
   4. Проверьте край пластины, так как там могут оказаться черви. Кроме того, подсчитайте и запишите количество червей в центральной точке (Рисунок 1D).
7. Продолжайте размечать все пластины для анализа по порядку, чтобы все пластины имели 30 минут активности, тщательно учитывая время, затраченное на установку пластины. Затем выполните ручные или цифровые измерения, как описано в шагах 1.8 или 1.9.
8. Выполняйте измерения вручную с помощью линейки.
   1. С помощью линейки измерьте расстояние в мм от центральной точки до конечной разметки местоположения для каждого червя и запишите расстояние. Чтобы отслеживать прогресс во время подсчета очков, обозначьте первое набранное очко небольшой линией.
   2. Записывайте данные о длине для каждой точки последовательно, вращая пластину по часовой стрелке (Рисунок 1E).
9. Выполняйте цифровые измерения с помощью сканера и ImageJ.
   1. С помощью планшетного сканера отсканируйте обратную сторону пластины (пластин) для анализа рядом с линейкой (цифры обращены к сканируемой поверхности) (Рисунок 2A).
   2. Откройте отсканированное изображение пластины в программе ImageJ или аналогичной программе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: ImageJ - это бесплатное программное обеспечение для обработки изображений на основе Java, размещенное NIH.
   3. Нажмите на Инструмент "Прямая линия" , а затем нарисуйте линию, соединяющую точки 1 см и 2 см на отсканированном изображении линейки (Рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удерживание клавиши Shift компьютер принудительно переместит линию под ближайший угол 45°.
   4. Перейдите в меню Analyze и используйте его для установки масштаба (Analyze | Установите масштаб) (Рисунок 2C).
   5. Введите Известное расстояние (10) и Единицы длины (мм) в соответствующие поля, не регулируйте расстояние в пикселях. Отметьте Global , чтобы применить один и тот же масштаб ко всем изображениям, анализируемым в каждой сессии ImageJ; в противном случае установите масштаб для каждого изображения при открытии (Figure 2D). Нажмите Ok.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.9.2-1.9.5 выполняются для установки шкалы измерения. Измерения для этого изображения теперь будут автоматически связывать длину линий с заданным отношением пиксель: длина. Изображения, отсканированные с разрешением 300 точек на дюйм, будут иметь приблизительное соотношение 11,8 пикселей на мм.
   6. Используйте инструмент Кисть, чтобы отметить чуть выше первого очка, который нужно набрать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это визуальный индикатор для первого забитого червя.
   7. Используйте инструмент Straight-Line Tool, чтобы провести линию от центральной точки до первой точки данных червя.
   8. Нажмите клавишу M на клавиатуре, чтобы измерить расстояние. В качестве альтернативы перейдите в меню Analyze и выберите Measure (Analyze | Measure). В обоих случаях измерение появится в новом окне; В этом окне будут собраны все измерения для каждого изображения.
   9. Сохраняя центральную точку постоянной, переместите конец линии, касающейся первой точки червя, к следующей точке червя, двигаясь по часовой стрелке, и нажмите клавишу M для измерения.
   10. Продолжайте измерять каждую точку по часовой стрелке, пока все точки не будут набраны.
   11. Скопируйте и Вставьте данные измерения длины в таблицу, чтобы сохранить их. Затем повторите процесс для каждого отсканированного изображения пластины.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 1.9.6 - 1.9.11 измеряют значения смещения червя (Рисунок 2E-F).
10. Выполнение статистического анализа.
    1. Объедините повторения в одном эксперименте так, чтобы общее количество полученных червей составило 30-40.
    2. Проводите независимые экспериментальные репликации в разные дни и с независимыми популяциями червей, чтобы получить 3 независимых экспериментальных репликации.
    3. Анализируйте данные с помощью соответствующего статистического анализа, такого как t-критерий Стьюдента для 2 штаммов или 1-факторный ANOVA для трех или более штаммов.

Результаты

Рисунок 1: Рабочий процесс анализа радиальной локомоции. На панелях A-E показаны обобщенные этапы анализа радиальной локомоции. Шаги следующие: (A) Пластины NGM с посевом OP50 по краям подготавливаются путем маркировки и маркировки центральной точки, (B) черви помещаются в центр агара, как отмечено центральной точкой, (C) червям раз...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
C. elegans	Центр генетики ценорхабдита (CGC)	-	Приобретайте свои штаммы по своему усмотрению, N2 является полезным контрольным штаммом
Одноразовые пастерные пипетки, боросиликатное стекло	VWR	14673-010	Стеклянная пипетка, используемая для создания червячной палочки - держите стеклянную пипетку в одной руке и ~1" платиновой проволоки (удерживаемой плоскогубцами) в другой над пламенем для соединения.
Одноразовые чашки Петри, 35x10мм	VWR	10799-192	Пробирные пластины для системы визуализации WormLab
Одноразовые чашки Петри, 60x15мм	VWR	25384-090	Стоковые пластины для червей
Одноразовые чашки Петри, 100x15мм	VWR	25384-302	Стандартная пластина для анализа радиальной локомоции
Одноразовые чашки Петри, 150x15мм	VWR	25384-326	Радиальная пластина для анализа передвижения с более длительным таймфреймом
Препарирующий микроскоп	Leica	М80	Возможности для содержания глистов и постановки анализов радиальной локомоции
Маркеры с тонким наконечником	VWR	52877-810	Необходимо как минимум 2 цвета для анализов радиальной локомоции. Для точности требуются тонкие советы.
Планшетный сканер	Амазонка	Epson Perfection V850	Опционально для анализа радиальной локомоции. Протокол предполагает разрешение 300 dpi, большинство сканеров будут работать нормально
NGM (среда для роста нематоды)	VWR	76347-412	Среда, используемая для выращивания C. elegans. Может быть изготовлен с нуля, см. WormBook: Обслуживание C. elegans
Бактерии OP50	Генетический центр канорхабдита (CGC)	ОП50	Основной источник пищи для C. elegans
p1000 пипеттор	VWR	76207-552	Пипеттор, используемый в анализе плавания
p1000 советов	VWR	83007-384	Советы для пипетки, используемые при плавании
Платиновая проволока, диаметр 0,2032 мм	VWR	BT136585-5M	Платиновая проволока тонкого калибра, используемая для создания червячной кирки - держите стеклянную пипетку в одной руке и ~1 дюйм платиновой проволоки (удерживаемой плоскогубцами) в другой над пламенем для соединения.
Линейка	VWR	56510-001	Необходимо оценить анализы радиальной локомоции
ИзображениеJ	NIH	-	Опциональное бесплатное программное обеспечение, предоставленное NIH - https://imagej.nih.gov/ij/
Система визуализации WormLab	MBF Bioscience	Червячная лаборатория	Система визуализации включает в себя Аппаратное обеспечение WormLab (светлое поле сцена, камера и корпус) и программное обеспечение WormLab. https:// www.mbfbioscience.com/wormlabimaging- система