Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Подготовка
- Препарирование тканей и секция
- Случайным образом разделите крыс на три группы: свежие/солевые (SAL; 0,9% NaCl), префиксные/SAL и префиксные/3,4-метилендиоксиметамфетамин (MDMA; подробности см. в таблице 1).
- Вводите три дозы 1 мл/кг САЛ и 10 мг/кг МДМА внутрибрюшинно, соответственно, в группы САЛ и МДМА с интервалом в 2 часа. Дайте животным пережить лечение в течение 6 дней.
- На 7-й день введите 100 мг/кг кетамина в комбинации 5 мг/кг ксилазина внутрибрюшинно крысам для глубокой анестезии (т.е. потери рефлексов моргания роговицы и зажима хвоста).
- Для группы fresh/SAL быстро обезглавьте крыс и удалите мозг для теста свежего мозга.
- Для групп с префиксом / SAL и префиксом / MDMA сделайте разрез вдоль грудины примерно на 10 -12 см, а затем обнажите конец грудины.
- Зажмите конец грудины кровоостанавливающим средством и острыми ножницами разрежьте диафрагму сбоку с обеих сторон, а затем разрежьте вверх поперек ребер и параллельно легким.
- Одной рукой придерживайте вентральный кончик сердца небольшими щипцами. Другой рукой проткните левый желудочек иглой шприца 18 G (обратите внимание, что переходная сторона иглы соединена с Y-образным силиконовым шлангом к ледяным контейнерам с SAL и параформальдегидом и перистальтическим насосам).
- Включите насос SAL на среднем уровне расхода (~5 мл/мин) и проколите щипцами правое предсердие, чтобы обеспечить выход обратного кровообращения. Поддерживайте перфузию SAL в течение 30 минут.
- Включите насос параформальдегида на среднем уровне и дайте ледяному 4% параформальдегиду пропитать животное в течение 30 минут.
- Извлеките перфузионный инструмент и обезглавьте животное. Сделайте заднепередний разрез через среднюю линию черепа, а затем взмахните черепом, чтобы обнажить полость черепа.
- Извлеките мозг с помощью шпателя из полости черепа и поместите мозг в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл 4% параформальдегида. Держите мозг в трубке, содержащей параформальдегид, при температуре 4 ºC в холодильнике в течение 24 часов.
- Переместите мозг в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 25 мл 30% раствора сахарозы при температуре 4 ºC, на 3 дня. Наконец, храните мозг в пластиковых пакетах при температуре -80 °C до использования.
- Установите мозг на патрон с закладной средой и заморозьте встраивающую среду, содержащую мозг, в криостате при температуре -26 ºC. Разрежьте свежезамороженный мозг на участки размером 20 мкм, а мозг с префиксом параформальдегид — на участки размером 10 мкм. Перенесите срез на предметное стекло микроскопа при комнатной температуре (ОТ), прикоснувшись предметным стеклом к срезу.
- Сушите на воздухе при температуре RT в течение 4 часов. Храните секционные стекла в плотно закрытом пакете при температуре -80 °C до использования.
- обезвоживание
- Возьмите слайды из морозильной камеры при температуре -80 °C и распределите срезы по одному из трех тестов: ген рецептора серотонина 5-HT2A (ht2a), ppiB (ген пептидилпролилизомеразы B, положительный контроль) или dapB (ген бактериальной дигидродипиколинатредуктазы, отрицательный контроль); отметьте и обозначьте срезы шариковой ручкой (не используйте карандаш). Погрузить предметные стекла в 100% спирт при температуре RT на 5 минут. Просушите предметные стекла в течение 5 минут в вытяжном шкафу.
- предварительная обработка
- Пипеткой 20 мкл реагента Предварительная обработка-1 (инактивация щелочной фосфатазы) в срезы на предметных стеклах. Поместите предметные стекла на решетку в лоток для влаги (обратите внимание, что лоток накрыт крышкой для поддержания высокой влажности и предотвращения испарения из реакционного раствора).
- Осторожно встряхните лоток для влаги на горизонтальном шейкере на низкой скорости в течение 10 мин. Дважды промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой (ddH2O) в течение 2 мин. Погрузите предметное стекло в стакан объемом 200 мл, содержащий 150 мл реагента Pretreatment-2 (разрыв поперечных связей, вызванный фиксацией параформальдегида). Кипятите предметные стекла в общей сложности 5 минут при 100 ºC (восстановление структуры РНК под действием тепла).
- Дважды промойте предметные стекла с помощью ddH2O в течение 2 минут. Поместите предметные стекла в 100% спирт на 5 минут. Высушите предметные стекла в течение 5 минут в вытяжном шкафу. С помощью гидрофобной ручки нарисуйте круг вокруг выбранной области на участке ткани (например, некортикальные структуры, включая таламус и гипоталамус, как показано на рисунке 1).
- Нанесите пипеткой 10 мкл реагента Предварительная обработка-3 (увеличивает проникновение зонда) в каждую выбранную область и накройте лоток для влаги крышкой. Поместите противень в печь для гибридизации, оснащенную горизонтальным встряхивателем, и установите температуру духовки на уровне 40 ºC; Аккуратно встряхивайте противень в течение 30 минут. Вымойте предметные стекла дважды с ddH2O в течение 2 минут.
2. Гибридизация и амплификация
- Пипеткой 10 мкл htr2a, ppiB и dapB зондирующих реагентов соответственно на выбранные участки. Накройте лоток для влаги крышкой, чтобы предотвратить испарение реагента. Аккуратно встряхните на горизонтальном шейкере, установленном на низкой скорости. Выдержите горки при температуре 40 ºC в духовке в течение 2 часов.
- Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин. Пипеткой нанесите 10 мкл реагента Amplification-1 на каждую выбранную область, встряхните и инкубируйте предметные стекла при температуре 40 ºC в течение 30 мин.
- Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин. Нанесите пипеткой 10 мкл реагента Amplification-2 на каждую выбранную область, встряхните и инкубируйте предметные стекла при температуре 40 ºC в течение 15 мин.
- Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин. Пипеткой нанесите 10 мкл реагента Amplification-3 на каждую выбранную область, встряхните и инкубируйте предметные стекла при температуре 40 ºC в течение 30 мин.
- Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин. Пипеткой нанесите 10 мкл реагента Amplification-4 на каждую выбранную область, встряхните и инкубируйте предметные стекла при температуре 40 ºC в течение 15 мин.
- Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин. Нанесите пипеткой 10 мкл реагента Amplification-5 на каждую выбранную область, встряхните и инкубируйте предметные стекла при RT в течение 30 мин.
- Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин. Нанесите пипеткой 10 мкл реагента Amplification-6 на каждую выбранную область, встряхните и инкубируйте предметные стекла при RT в течение 15 мин. Дважды промойте предметные стекла промывочным буфером в течение 2 мин.
3. Обнаружение сигналов
- Нанесите пипеткой 10 мкл реактива Red на каждую выбранную область (обратите внимание, что реактив представляет собой смесь Red-B и Red-A в соотношении 1:60 и должен быть использован немедленно). Поместите предметное стекло в лоток для влаги на горизонтальный шейкер в положении RT и осторожно встряхивайте на низкой скорости в течение 10 минут.
- Дважды промойте предметные стекла с помощью (ddH2O) в течение 10 минут. Высушите предметные стекла при температуре 60 ºC в духовке в течение 15 минут. Поместите предметные стекла в ксилоле под вытяжной шкаф на 5 минут. Нанесите пипеткой 20 μл монтажного материала на основе ксилола на каждую выбранную область и накройте покровным стеклом.