Все процедуры, связанные с образцами животных, были рассмотрены и одобрены соответствующим комитетом по этической экспертизе животных.
1. Срез мозга
- Ориентируйте образец таким образом, чтобы дорсальная сторона мозжечка находилась на лицевой стороне. Залить ледяной холодной резкой ACSF (искусственную спинномозговую жидкость), содержащую 1 мкМ TTX (тетродотоксина), достаточную для полного погружения в мозжечок. Поместите газовую трубку в ACSF и начните пузыриться газовой смесью O2/CO2.
- Удалите паутинную оболочку с помощью тонкого пинцета под биноклем. Срежьте лезвием плодоножку мозжечка, а ствол мозга и агаровый блок удалите. Поверните лоток на 180°, так, чтобы тыльная поверхность мозжечка была обращена к лезвию бритвы.
- Установите лезвие и отрегулируйте первое место резки. Установите следующие параметры нарезки вибратома: амплитуда 5,5, частота 85 Гц, скорость 3–4 и толщина среза 300 мкм.
- Перенесите срез мозжечка на нейлоновой сетке в акриловый инкубатор и полностью погрузите срез в насыщенный кислородом ACSF. Инкубатор следует поместить на водяную баню, поддерживающую температуру 26 °C.
- Храните ломтики не менее 1 часа, чтобы обеспечить восстановление повреждений во время нарезки.
2. Запись патч-зажима для всей клетки
ПРИМЕЧАНИЕ: Для записи с патч-зажимом требуется следующее оборудование: вертикальный микроскоп с инфракрасной дифференциально-интерференционно-контрастной оптикой (IR-DIC), усилитель с патч-зажимом, дигитайзер данных, цифровой стимулятор, изолятор, компьютер, программное обеспечение для сбора и анализа данных, моторизованный манипулятор, платформа для микроскопа, виброизоляционный стол, клетка Фарадея, система нагрева раствора, перистальтические насосы и съемник электродов.
- Добавьте пикротоксин (0,1 мМ) в ACSF и рассосите его с помощью ультразвука в течение 3 мин.
- Перфузируйте записывающую камеру с пикротоксинсодержащими, O2-CO2-насыщенными ACSF со скоростью 2 мл/мин. Поддерживайте температуру записывающей камеры на уровне около 30 °C.
- Сделайте записывающий электрод, потянув за капилляр из боросиликатного стекла с нитью накаливания (наружный диаметр = 1,5 мм) с помощью съемника с 4 ступенями. Диаметр кончика должен быть около 1 мкм.
- Сделайте стимулирующий электрод, потянув за один и тот же капилляр с помощью съемника в 2 этапа, затем разломайте до получения тонкого наконечника, ударив наконечником по железному блоку под бинокулярным микроскопом. Конечный диаметр должен составлять 3–5 мкм.
- Перенесите срез мозжечка в камеру записи и зафиксируйте его Pt-грузом с капроновыми нитями. Заполните стимулирующий электрод с помощью ACSF.
- Для стимуляции ПФ поместите стимулирующий электрод на поверхность молекулярного слоя, на расстоянии около 50 мкм от слоя клеток Пуркинье.
- Для стимуляции КФ поместите стимулирующий электрод в нижнюю часть слоя клеток Пуркинье (шаги 3.3, 3.4).
- Фильтруйте внутренний раствор на основе K+ или Cs+ с фильтром 0,45 мкм. С помощью микрозагрузчика заполните записывающий электрод 8 мкл внутреннего раствора.
- Перед погружением в ACSF к записывающему электроду приложите слабое положительное давление. Его сопротивление должно составлять 2–4 МОм, а потенциал перехода жидкости должен быть скорректирован.
- Подойдите к здоровому, яркому телу клетки ПК с помощью записывающего электрода. Слегка надавите на поверхность ячейки Пуркинье, прекратите оказывать положительное давление, затем приложите отрицательное давление до образования гигаомного уплотнения. Затем установите конфигурацию всей ячейки с помощью отрицательного давления.
- Удерживайте потенциал мембраны на уровне -70 мВ и подавайте импульс -2 мВ (продолжительность 100 мс) с частотой 0,1 Гц для непрерывного контроля входного сопротивления, последовательного сопротивления и входной емкости. Не используйте последовательную компенсацию сопротивления. Отбрасывайте данные, когда последовательное сопротивление изменяется более чем на 15%.
3. Индукция LTD (Долгосрочная депрессия)
- Стимулируйте молекулярный слой импульсом (продолжительность 0,1 мс). Определите PF(параллельные волокна)-возбуждающие постсинаптические токи (EPSC) путем применения двойного импульсного стимула (межспайковый интервал (ISI) 50 мс). PF-EPSC должен демонстрировать фасилитацию парных импульсов и постепенное увеличение амплитуды относительно увеличения интенсивности стимуляции.
- Запишите тестовую реакцию PF-EPSC путем подачи одного импульса с частотой 0,1 Гц. Отрегулируйте интенсивность стимула таким образом, чтобы амплитуда вызываемого EPSC составляла около 200 пА. Избегайте загрязнения тока через потенциал-зависимый ионный канал.
- Стимулируйте КФ в нижней части клеточного слоя Пуркинье и определите ЭПСК, вызванный активацией КФ (путем применения двойного импульсного стимула). CF-EPSC должен показывать парную импульсную депрессию и принцип «все или ничего» в зависимости от увеличения интенсивности стимуляции. Для индукции LTD следует использовать один стимул.
- LTD-индуцирующий протокол 1
- Используя электрод, содержащий внутренний раствор на основе K+ в условиях тока-зажима, подайте один PF-стимул и один CF-стимул одновременно с частотой 1 Гц в течение 5 мин (300 импульсов) (Рисунок 1A).
- LTD-индуцирующий протокол 2
- Используя внутренний раствор, содержащий электрод K+ в условиях тока-зажима, применяйте двойные PF-стимулы (ISI 50 мс) и одиночный CF-стимул, так как второй PF-стимул совпадает с CF-стимулами при частоте 1 Гц в течение 5 минут (Рисунок 1B).
- LTD-индуцирующий протокол 3
- Используя электрод, содержащий внутренний раствор на основе Cs+ в условиях напряжения-зажима, примените двойной PF-стимул (ISI 50 мс) и одинарный шаг деполяризующего напряжения (от -70 до 0 мВ, 50 мс) к соме с частотой 1 Гц в течение 3 мин, чтобы второй PF-стимул был эквивалентен началу шага деполяризующего напряжения (Рисунок 1C).
- LTD-индуцирующий протокол-4
- Используя электрод, содержащий внутренний раствор на основе Cs+ в условиях напряжения-зажима, подайте PF-стимулы (5x при 100 Гц) и один шаг деполяризующего напряжения (от -70 до 0 мВ, 50 мс) на сому с частотой 0,5 Гц в течение 3 мин, одновременно (Рисунок 1D).
