Методическая статья

Модель in vitro для изучения пересечения патогеном гематоэнцефалического барьера и инфекции клеток мозга

957 просмотров

⸱

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

Источник: da Costa, A., et al. Модель взаимодействия крови и мозга человека для изучения пересечения барьеров патогенами или лекарствами и их взаимодействия с мозгом. J. Vis. Exp. (2019).

В этом видео демонстрируется модель in vitro для изучения патогенов, пересекающих гематоэнцефалический барьер (ГЭБ). Микрососудистые эндотелиальные клетки, которые экспрессируют плотные соединения, образуют эндотелиальный слой в верхней камере, в то время как нейроны, астроциты и микроглия представляют собой паренхиму мозга в нижней камере, разделенную пористой мембраной. Вирусная инфекция в модели ГЭБ имитирует проникновение патогена из крови в мозг. При введении нейротропного вируса он проникает через ГЭБ через трансцитоз, заражает нервные клетки, реплицируется и выпускает вирусное потомство, демонстрируя успешную нейроинвазию.

Протокол

1. Конструирование и контроль качества BBB-Minibrain (Гематоэнцефалический барьер - Minibrain) (Рисунок 1)

  1. Настройка устройства для вставки культуры полиэфирной мембраны BBB-Minibrain (Рисунок 1B)
    1. Выращивайте эндотелиальные клеточные линии мозга человека (клетки hCMEC/D3) на 12 лунках полиэфирных мембранных культур, вставляйте фильтры в течение 6 дней на среду эндотелиальных клеток перед использованием их для эксперимента.
    2. Покройте 12-луночный планшет поли-D-лизином (1 мл/лунка, 10 мкг/мл, 4 ч при ЛТ), а затем ламинином (1 мл/лунка, 1 мкг/мл, на ночь при ЛТ).
    3. Удалить ламинин и добавить 1 мл среды эндотелиальных клеток с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (5% среды эндотелиальных клеток).
    4. Инкубировать в течение 1 ч при 37 °C, 5% CO2 и влажности 95%.
    5. Мягко трипсинизируйте постмитотические нейроны человека (hNeurons) и человеческие астроциты (hAstrocytes) (NT2-N/A) и линию микроглиальных клеток человека (CHME/Cl5) и диссоциируйте клеточные гранулы с полной эндотелиальной клеточной средой.
    6. Подсчитайте клетки, смешайте 3,6 x 105 NT2-N/A и 0,4 x 105 CHME/Cl5 клеток/лунки и засейте 12-луночный планшет.
    7. При T=24 ч (через 24 ч после посева): замените используемую среду свежей полной средой эндотелиальных клеток (клетки Minibrain и эндотелиальные клетки) и перенесите фильтр для культур из полиэфирной мембраны hCMEC/D3 поверх клеток Minibrain. Инкубируйте BBB-Minibrain при 37 °C, 5% CO2 и влажности 95%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Затем BBB-Minibrain будет состоять из слоя эндотелиальных клеток человека hCMEC/D3 на фильтре, изолирующем просветной компартмент (или компартмент "крови") и смешанной культуры человеческих клеток hNT2-N/A и hCHME/Cl5 (Minibrain) на дне лунки, определяющей абулальный компартмент (или компартмент "мозга") (Рисунок 1B).
  2. Валидация эндотелиальной проницаемости BBB-Minibrain (контроль качества) (Рисунок 1C)
    1. Приготовьте транспортный буфер (TB), который представляет собой буфер HBSS (сбалансированный раствор соли Хэнкса) с Ca2+ и Mg2+ с добавлением 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинетансульфоновой кислоты (HEPES) и 1 мМ пирувата натрия.
    2. Приготовьте 12-луночные планшеты с 1,5 мл транспортного буфера на лунку.
    3. При T= 0 приготовить свежий транспортный буфер с добавлением 50 мкМ Lucifer Yellow (LY-TB).
    4. Переверните каждый фильтр вверх ногами, чтобы аккуратно удалить среду, не затрагивая эндотелиальный клеточный барьер.
    5. Поместите фильтр на заполненную 12-луночную пластину и добавьте 0,5 мл LY-TB.
    6. Инкубируйте планшеты в инкубаторе при температуре 37°C, 5% CO2 и влажности 95%.
    7. При Т=10 мин переложить фильтры на новые ТБ заполненные 12 лунок пластины и сохранить аблюминальный отсек первой пластины для считывания ОД.
    8. При T= 25 мин повторите шаг 1.2.7.
    9. При T = 45 мин остановите транспортировку, сняв фильтры с пластин. Сохраняйте алюминальный и люминальный отсеки для измерения наружного диаметра.
    10. Переложите в темные 96 лунки пробы из 96 лунок: 10 мкл с 190 мкл TB для LY-TB и просветных компартментов, 200 мкл пробы для аблюминальных компартментов.
    11. Измерьте флуоресценцию LY-TB, присутствующего в различных образцах, на длине волны λ428 нм и 535 нм (волны возбуждения и длины излучения соответственно).
    12. Рассчитайте эндотелиальную проницаемость (Pe) в сторону LY-TB (PeLY) по формуле:
      1/PSe= (1/PSt) – (1/PSf) и PeLY= PSe/S.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PSf - проницаемость фильтра без ячеек, PSt - проницаемость фильтра с ячейками, PSe - проницаемость эндотелиального монослоя, временная на поверхность монослоя, S - поверхность монослоя (для 12-луночного фильтра = 1,12 см2), PeLY выражается в см/мин. Для hCMEC/D3 значение PeLY должно составлять от 0,7 до 1,2 x 10-3 см/мин, в зависимости в основном от FBS, используемого в экспериментах. Важно: PeLY выше 1,2 означает, что BBB недостаточно плотный и может наблюдаться некоторая утечка. Отбросьте эти барьеры.

2. Использование BBB-Minibrain для выделения присутствия нейроинвазивных вирусных частиц в образце вакцины против вируса желтой лихорадки, французского нейротропного вируса, YFV-FNV 34 (Рисунок 2)

  1. Скрещивание ГЭБ и размножение вирусов желтой лихорадки в минимозге
    1. Используйте BBB-Minibrain, приготовленный, как описано в шаге 1.1.7, за 24 ч до добавления вируса; заменить среду на 2% среду эндотелиальных клеток FBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чрезвычайно важно избегать смены среды непосредственно перед добавлением вируса. Изменение среды может активировать эндотелиальные клетки человека и временно открыть барьер, который позволит вирусу пройти. При этом среда меняется за 24 ч до начала эксперимента.
    2. При T= 0 очень осторожно добавьте 3500 единиц формирования бляшек (PFU) YFV-FNV, разведенных в 50 мкл 2% среды эндотелиальных клеток FBS, в верхнюю часть просветного компартмента. Контрольный BBB-Minibrain инокулируют 50 мкл 2% эндотелиальной клеточной среды FBS без вируса. Определите PeLY на компаньонном колодце.
    3. Инкубируйте BBB-Minibrain в инкубаторе при температуре 37 °C, 5% CO2 и влажности 95%.
    4. Через 24 ч удалить полиэфирную мембрану с культуральными вставками фильтрующего устройства и определить PeLY, взять образец 1 мл из алюминального компартмента и титровать вирус. Замените среду свежей 2% средой эндотелиальных клеток FBS.
    5. Инкубируйте BBB-Minibrain при температуре 37 °C, 5% CO2 и влажности 95%.
    6. Через 72 ч возьмите образец среды из алюминального компартмента и титруйте вирус и/или извлеките РНК из клеток Minibrain для анализа экспрессии генов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 1: Модель BBB-Minibrain. А. График проведения культур hCMEC/D3 и фотография устройства BBB-Minibrain: фильтр из полиэфирной мембраны с эндотелиальным барьером hCMEC/D3 удерживают щипцом перед тем, как ввести в одну лунку из 12 лунок клеточной культуральной тарелки. B. Мультфильм с описанием устройства с просветным (Кровяным) компартментом, содержащим эндотелиальный клеточный ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 луночных пластинКорнинг3336
85 мм Чашка ПетриSarstedt83-3902-500
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleПо запросу к доктору Лафону
КМСКальбиохим217274
Темные 96-луночные пластиныКорнинг3915
DMEM F12Термофишер Научный31330-038
ДМСОМерк-Сигма ОлдричD2650
Эндогро IVМиллипорSCME004
ЭтанолКарло Эрба529121
ФБСГиклонSV30015-04эндотелиальная клеточная среда
HBSS с Ca2+-Mg2+Термофишер Научный14025-100
hCMEC/D3КедарланCLU512
Hepes 1MТермофишер Научный15630-070
ЛамининМерк-Сигма ОлдричL6274
L-глутаминТермофишер Научный25030-024
Желтый ЛюциферМерк-Сигма ОлдричL0259
MEM 10XТермофишер Научный21430
MEM 1XТермофишер Научный42360
Ntera/Cl2D.1АТССCRL-1973
ПараформальдегидНауки об электронной микроскопии15714
PBS без Ca2+-Mg2+Термофишер Научный14190
PBS-CA2+-mg2+Термофишер Научный14040-091
Перо/стрептококкЕвробиоCXXPES00-07
Поли-d-лизинМерк-Сигма ОлдричP1149
Продлить золотоТермофишер НаучныйP36930
Набор для очистки РНКQIAGEN74104
Бикарбонат натрия 5,6%ЕвробиоCXXBIC00-07
Пируват натрияТермофишер Научный11360
T75 Клетка+ ФлягаСарштедт83-1813-302Колба из полистирола для тканевых культур со специфической обработкой поверхности (Cell+) для чувствительных адгезивных клеток
ТрансвеллКорнинг3460Вставки для культуры полиэфирных пористых мембран
Трипсин-ЭДТАМерк-Сигма ОлдричТ3924
Ультра чистая водаТермофишер Научный10977-035
VerseneТермофишер Научный15040-033ЭДТА
YFV-FNVИП ДакарФлакон с вакциной

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи