1. Подготовка мух к экспериментам MultiColor FlpOut (MCFO)
ПРИМЕЧАНИЕ: Метод MCFO относится к модифицированной версии так называемого Flp-опосредованного иссечения стоп-кассеты (FlpOut). Трансгенные мухи MCFO несут промотор теплового шока (hsp)-Flp-рекомбиназу и различные репортеры под контролем восходящей последовательности активации (UAS). Каждый репортер состоит из общей основы миристоилированного (myr) суперпапки зеленого флуоресцентного белка (sfGFP), в который вставлено 10 копий эпитопной метки (например, HA, FLAG или V5). Полученные нефлуоресцентные белки называются «спагетти-монстрами GFP» (smGFP) и могут быть обнаружены с помощью специфических антител против различных эпитопных меток.
- Перекрестные мушки с кассетой MCFO и hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) на соответствующие глиальные линии драйвера GAL4 (см. Таблицу материалов).
- Поскольку hsp уже активен при 25 °C и некоторые клетки могут подвергнуться рекомбинации, ведущей к неспецифическому мечению, установите крестики при 18 °C, чтобы избежать утечки системы. Подождите около 20 дней при 18 °C, чтобы получить поколение F1. После теплового шока (см. шаг 2) поддерживайте температуру от мух при температуре 25 °C (рис. 1).
2. Тепловой шок
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от места введения, эффективность hsp-Flp может отличаться, поэтому необходимо оптимизировать оптимальное время теплового шока. Для этого протокола был использован приклад MCFO у мухи, в который hsp-Flp был вставлен на Х-хромосому (см. Таблицу материалов).
- Пересадите потомство креста на шаге 1.1 (мухи поколения F1, возрастом 3-4 дня) в новые флаконы, содержащие пищу, и шокируйте их при температуре 37 °C на водяной бане.
заметка: Молодые мухи (в возрасте 1-2 дней) очень чувствительны к тепловому удару. Подождите еще 1 или 2 дня перед проведением теплового шока, чтобы снизить уровень смертности, вызванной лечением. Используйте некоторые мухи поколения F1 в качестве управления, без теплового шока.
- Во время теплового шока держите мух в обычных флаконах с пищей, чтобы снизить уровень смертности, вызванной стрессом. Поместите самок и самцов в отдельные флаконы.
- Обязательно погрузите весь флакон в воду, чтобы обеспечить равномерный тепловой шок. Используйте удар продолжительностью 5-8 минут в качестве подходящей отправной точки для разреженной маркировки клеток глии с большим количеством линий драйвера GAL4; Продолжительность удара должна быть оптимизирована для каждого водителя и эксперимента (может потребоваться более короткое или более длительное время теплового удара).
- После теплового удара положите флаконы горизонтально на скамейку на несколько минут, чтобы дать мухам возможность оправиться от теплового удара.
заметка: Менять флаконы не нужно.
- Поддерживайте температуру мух при температуре 25 °C и препарируйте их (см. шаги 3 и 4) через 2 или более дней после теплового шока для оптимальной экспрессии репортера.
3. Подготовка к вскрытию и растворы
- В день вскрытия приготовьте свежий фиксирующий раствор в ПЦР-пробирках объемом 200 мкл, смешав 180 мкл среды для культивирования клеток S2 с 20 мкл 20% параформальдегида (PFA) до получения 2% раствора PFA. Держите фиксирующий раствор на льду до и во время вскрытия.
осторожность: PFA токсичен и с ним следует обращаться осторожно.
заметка: Смешайте 160 мкл среды для культивирования клеток S2 с 40 мкл 20% параформальдегида (PFA) в пробирке полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 200 мкл для получения 4% раствора PFA вместо 2% раствора.
- Используйте одну ПЦР-пробирку для каждого генотипа, максимум 8-10 мозгов на пробирку для достижения оптимальных результатов окрашивания.
- Приготовьте раствор для промывания мозгов взрослых: 0,5% альбумин бычьей сыворотки, 0,5% Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBS).
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от окрашивания может потребоваться раствор, содержащий 1% Triton X-100. Более высокая концентрация Triton X-100 увеличивает проникновение антитела в ткань, и необходимо окрашивать участки, которые лежат глубоко внутри ткани (например, синаптические области в мозге взрослой дрозофилы).
- Приготовьте раствор для блокирования: 3% обычная сыворотка для коз, 3% обычная сыворотка для осла и 0,5% Triton X-100 в PBS.
- Раствор для промывания мозга взрослого человека и блокирующий раствор можно хранить при температуре 4 °C в течение нескольких недель.
- Положите глубокую углубительную лунку на стеклянную пластину на лед и заполните каждую лунку следующими растворами: один с 70% этанолом, один с PBS и один с S2 питательной средой для клеточных культур.
4. Вскрытие мозга у взрослых
- Установите 3-сантиметровую препарирующую чашку на столик стереомикроскопа и заполните ее холодной средой для культивирования клеток S2. Проводите все вскрытия в этой среде, чтобы убедиться, что ткань остается здоровой во время процедуры диссекции.
заметка: Используйте чашку для препарирования, выстланную несколькими миллиметрами черного силикона, который обеспечивает хороший контраст фона (на изображениях), и сохраните щипцы во время рассечения.
- Обезболить мух нужного генотипаСО2.
- Щипцами возьмите муху за крылья и промойте ее в холодном 70% этаноле в течение 30 с, затем холодным PBS еще 30 с.
- Перенесите муху в глубокую углубление, заполненную средой для культивирования клеток S2.
- Повторите ту же процедуру для всех мух одного и того же генотипа и поддерживайте их в холодной среде для культивирования клеток S2 до рассечения, которое сохранит ткань><.
заметка: Обезболивайте только то количество мух, которое можно препарировать за промежуток времени около 30 минут. Длительное время инкубации в среде для культивирования клеток S2 может привести к повреждению ткани.
- Захватите муху щипцами и под стереомикроскопом погрузите муху в среду для культуры клеток S2.
- Отделите голову от остального тела. Выбросьте тело и держите голову погруженной в среду для культивирования клеток S2. Крайне важно удерживать голову щипцами в течение всего времени диссекции. Если голова начинает плавать, ее будет трудно извлечь, не повредив ткани.
- Начните вскрытие с вытаскивания одного глаза, при этом все время удерживая голову как минимум одним щипцом. Убедитесь, что кончик щипцов находится чуть ниже сетчатки, чтобы не повредить ткани под ним. Вытащите другой глаз и начинайте удалять кутикулу до тех пор, пока не появится мозг.
- Удалите всю ткань трахеи и кутикулу вокруг мозга до тех пор, пока ткань не станет чистой. Обязательно удалите всю ткань трахеи вокруг мозга для достижения оптимальных результатов окрашивания; Теперь ткани готовы к фиксации и окрашиванию.
- Поддерживайте весь расчлененный мозг в холодной среде для культивирования клеток S2 перед тем, как перенести их в раствор PFA, чтобы рассчитать время этапа фиксации.
5. Окрашивание мозга у взрослых
- Перенесите изолированный мозг с помощью пипетки P10 в раствор PFA при комнатной температуре (RT). Чтобы избежать повреждения тканей, никогда не используйте щипцы для переноса мозга после вскрытия. Выполните все шаги в ПЦР-пробирках объемом 200 мкл на нутаторе.
- На всех этапах, прежде чем выбрасывать старый раствор с помощью пипетки P200, дайте мозгу осесть на дне пробирки. Постарайтесь удалить надосадочную жидкость без аспирации ткани. Беречь ткань от воздействия света.
- Зафиксируйте мозг в 200 мкл 2% PFA в среде для культивирования клеток S2 в течение 1 ч или в 4% PFA в течение 30 минут. Поддерживайте одинаковое время фиксации между образцами для повышения воспроизводимости.
- После 3 (или более) промываний по 15 минут каждое в 200 мкл раствора для промывания мозга взрослого человека заблокируйте ткани 200 мкл блокирующего раствора на 30 минут. Возможно увеличение времени инкубации в блокирующем растворе.
- Инкубируйте мозг в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, разведенными в растворе для промывания мозга взрослых в общем объеме 200 мкл.
заметка: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа используемых антител. Может потребоваться более длительная инкубация.
- Для мечения трех маркеров MCFO инкубируйте мозг с первичными антителами против HA (1:500), анти-FLAG (эпитоп DYKDDDDK) (1:100) и анти-V5.
- Первичные непосредственно конъюгированные антитела могут быть использованы вместо обычной комбинации первичный + вторичный (например, анти-V5:DyLight 549 (1:200)). В этом случае непосредственно конъюгированные антитела следует рассматривать как вторичные антитела.
заметка: Для каждого генотипа оставьте несколько мозгов в качестве контрольных, чтобы проверить специфичность окрашивания. Пропустите первичную инкубацию антител и сразу переходите к следующему этапу.
- Промойте ткани 3 раза в течение 1 ч в 200 мкл раствора для промывания мозга взрослых (шаг 3.3) и инкубируйте их со вторичными флуорофор-конъюгатами/первичными прямо-конъюгированными антителами, разведенными в растворе для промывания мозга взрослых в течение ночи при 4 °C или в течение 4 ч в режиме ОТ, в общем объеме 200 мкл<бр/>
заметка: Примеры подходящих антител: AlexaFluor 488 (1:250), анти-V5:DyLight 549 (1:200) и DyLight 647 (1:100)-конъюгированные антитела.
- Промывайте мозги 3 раза в течение 1 ч в 200 мкл раствора для промывания мозгов взрослых, затем заключительное промывание в 200 мкл PBS на ночь при 4 °C или в течение 1-2 ч при RT; заключительный этап промывания в PBS удаляет любые следы Triton X-100 и необходим для оптимальных результатов окрашивания. Закрепите мозги в монтажной среде с антивыцветающим средством на стеклянных покровных стеклах.
6. Монтирование мозга для визуализации
- Обрежьте распорку для визуализации до соответствующего размера с помощью ножниц. Для микроскопии с высоким разрешением поместите образец и прокладку для визуализации между двумя стеклянными покровными стеклами.
заметка: Распорки для визуализации представляют собой тонкие (толщиной 0,12 мм) адгезивные спейсеры, которые отслаиваются и прилипают к стеклянным покровным стеклам или предметным стеклам микроскопа, что позволяет устанавливать образцы без сжатия.
- С помощью щипцов снимите клейкую подкладку с одной поверхности и приложите спейсер клейкой стороной вниз к поверхности стеклянного покровного стекла (22 мм х 60 мм). Нанесите 10 μл монтажного носителя на новую стеклянную защитную крышку.
- С помощью пипетки P10 перенесите мозги из пробирки объемом 200 мкл на покровное стекло рядом с каплей монтажной среды. Вместе с тканями перенесите некоторое количество PBS для того, чтобы поддерживать мозг в растворе.
- С помощью пипетки P10 переместите мозг из PBS в каплю монтажной среды, стараясь ограничить количество PBS. Перенесите образцы в монтажной среде на покровное стекло с помощью прокладки для визуализации. Используйте достаточное количество монтажного носителя, чтобы накрыть образец.
- Снимите другой клейкий вкладыш с верхней стороны распорки и добавьте стеклянный покровный лист поверх образцов. Кончиком щипцов слегка надавите на область клея, чтобы запечатать. Немедленно сфотографируйте смонтированные ткани или сохраните предметные стекла при температуре -20 °C для последующего анализа.
