Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммунофлуоресцентное окрашивание мозга дрозофилы для визуализации глиальных клеток на отдельных клетках

1.1K просмотров

⸱

8 июля 2025 г.

В этой статье

Аннотация

Источник: Batelli, S., et al. Применение метода MultiColor FlpOut для изучения морфологии одиночных клеток с высоким разрешением и клеточных взаимодействий глии у Drosophila. J. vis. exp. (2017).

В этом видео демонстрируется иммунофлуоресцентное окрашивание мозга трансгенной дрозофилы для визуализации глиальных клеток в одиночных клетках. Мозг экспрессирует мембранно-целевые белки, слитые с различными комбинациями антигенных эпитопов под контролем глиально-специфической рекомбиназной системы. Изолированный и неподвижный мозг окрашивают первичными антителами, специфичными к антигенным эпитопам, за которыми следуют флуорофор-конъюгированные вторичные антитела. Эта маркировка позволяет одновременно визуализировать различные субпопуляции глиальных клеток в различных областях мозга.

Протокол

1. Подготовка мух к экспериментам MultiColor FlpOut (MCFO)

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод MCFO относится к модифицированной версии так называемого Flp-опосредованного иссечения стоп-кассеты (FlpOut). Трансгенные мухи MCFO несут промотор теплового шока (hsp)-Flp-рекомбиназу и различные репортеры под контролем восходящей последовательности активации (UAS). Каждый репортер состоит из общей основы миристоилированного (myr) суперпапки зеленого флуоресцентного белка (sfGFP), в который вставлено 10 копий эпитопной метки (например, HA, FLAG или V5). Полученные нефлуоресцентные белки называются «спагетти-монстрами GFP» (s....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

figure-results-1
Рисунок 1: Схема скрещивания для техники MCFO. Схема техники MCFO. Гомозиготных девственниц, несущих кассету MCFO и hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5), скрещивают со специфическими гомозиготными самцами драйвера GAL4. Затем поколение Формулы-1 подвергается тепловому удару. В зависимости от количества кассет FRT-sto.......

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Конфликт интересов не декларируется.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Водяная баняГрантGD100
ПЦР-пробиркиSarstedt72.737.002
ЩипцыДюмон11251-20
Чашка для препарирования 30 мм x 12 ммНауки электронной микроскопии70543-30Стеклянная тарелка для вскрытия
Pyrex 3 Стеклянная точечная пластинаКорнинг7223-34Стеклянные пластины для препарирования
Сильгард БлэкСИЛГАРД, Сигма-Олдрич805998дом на углях
Среда для культивирования клеток ExpressFive S2Invitrogen10486-025
20% PFAНауки электронной микроскопии15713
Тритон Х-100Рот3051.3
Обычная козья сывороткаЛаборатории Джексона005-000-121
Обычная ослиная сывороткаЛаборатории Джексона017-000-121
Бычья сыворотка альбуминСигмаА9647
HA-тег кроликаКлеточная сигнализацияC29F4Первичное антитело, разведение 1:500
Крысиный ФЛАГ-тегNovus BiologicalsNBP1-06712Первичное антитело, разведение 1:100
Мышь V5-тег:DyLight 549AdSerotec411Конъюгированное антитело, разведение 1:200
анти-кролик AlexaFluor 488InvitrogenА11034Вторичное антитело, разведение 1:250
антикрысиный DyLight 647Лаборатории Джексона712-605-153Вторичное антитело, разведение 1:100
Vecta ShieldВекторные лабораторииН-1000
Золото SlowFateInvitrogenС36937
Безопасная прокладка для пломбированияГрейс БиолабсСвяжитесь с компанией для оформления заказа
Защитное стекло микроскопа 22 X 60 ммМариенфельд101152
Защитное стекло микроскопа 22 x 22 ммРотH874
Стереомикроскоп, Leica MZ6Leica
Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM710Zeiss
ИммерсолZeiss518 FИммерсионное масло для флуоресцентной микроскопии, не содержит галогенов
ИммерсолZeissW 2010Погружная жидкость для погружных объективов в воде, не содержит галогенов
R56F03-GAL4 (EG)Блумингтонский фондовый центр39157Драйвер GAL4
R86E01-GAL4 (ALG)Блумингтонский стоковый центр45914Драйвер GAL4
hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5Блумингтонский стоковый центр64085Репортер БАС (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php)
Мультивременной макросZeissПрограммное обеспечение для автоматизированного сканирования

Больше статей

Мозг Drosophilaпервичный антителовторичное антителоконъюгация с флуорофоромфиксация тканейсреда для монтажаклеточно-специфическая рекомбиназа